第二代植物CRISPR/Cas9工具箱的研制

CRISPR/Cas9 has become the most popular technology for genome editing due to its easiness to use and high efficiency. Although the huge successes, CRISPR/Cas9 has two shortcomings, including insufficiency of Cas9 specificity and high variance of different sgRNA activity. The improved system which overcomes these two shortcomings can be regarded as second-generation CRISPR/Cas9 system. Based on recent advances, we will integrate high-fidelity Cas9 mutants, optimized sgRNA scaffold, and optimal expression strategy of sgRNA into second-generation system, which we will validate in Arabidopsis and maize. Furthermore, we will attempt to mutate some genes negatively regulating abiotic stress tolerance in maize, probing the potentiality of applications of CRISPR/Cas9 in breeding abiotic stress-tolerant maize lines. We anticipate that second-generation CRISPR/Cas9 toolkit will meet the demand of plant basic study and breeding in a better way.

CRISPR/Cas9以其易用性和高效性的优点成为主流基因组编辑技术。尽管取得了巨大成功，但CRISPR/Cas9存在Cas9特异性不够好和不同sgRNA活性差异大的缺点。我们把彻底解决这两个问题的CRISPR/Cas9系统称为第二代系统。本项目拟根据最新研究进展，通过整合高特异性Cas9、优化的sgRNA支架及更加高效的sgRNA表达策略，建立第二代CRISPR/Cas9植物基因组编辑系统，并在拟南芥和玉米中完成测试。我们还将尝试突变失活玉米中一些推测的负调控非生物逆境胁迫耐受性的靶基因，探讨CRISPR/Cas9技术在培育耐受非生物逆境胁迫玉米新品种上的应用潜力。项目拟建立的第二代CRISPR/Cas9植物基因组编辑工具箱，可以更好地满足植物基础研究和育种上的需求。

开展本项目的背景是CRISPR/Cas9基因组编辑技术存在Cas9特异性不够好和不同sgRNA活性差异大的缺点，为此我们尝试建立改进型的CRISPR/Cas9系统来克服这些缺点。项目的主要研究内容包括：在拟南芥和玉米中测试高特异性Cas9、优化的sgRNA支架及更加高效的sgRNA表达策略；整合这些策略，尝试建立高特异性、编辑效率高且对靶点序列依赖度低的第二代植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统。本项目取得了如下结果：发现在拟南芥中CRISPR/Cas9的脱靶效应不可忽视，而且脱靶效应在后代中会得到增强；当sgRNA支架为突变型时tRNA-sgRNA融合策略才不会影响编辑效率；高特异性Cas9变体只有在表达量很高的情况下才具有较高的编辑效率，Cas9的特异性和编辑效率之间存在相互制衡关系，更高的特异性以牺牲编辑效率为代价。关键数据如下：在编辑株系中发生脱靶的株系占比可高达87%，尽管sgRNA与脱靶点有3个不匹配碱基，且特异性评分为94%，表明在植物中脱靶问题不容忽视；当T1编辑株系中发生脱靶的株系占比为17%时，T2株系的脱靶频率可以进一步增加到63%，表明CRISPR/Cas9脱靶效应在后代中会得到增强；选取3个引导序列进行tRNA与sgRNA融合策略的测试，当sgRNA支架为原初型时3个sgRNA的编辑效率分别是4.7%、5.2%和1.3%，当sgRNA支架为突变型时编辑效率分别是13.4%、9.2%和12.4%，表明当sgRNA支架为突变型时tRNA与sgRNA融合策略更有效；选取2个sgRNA采用tRNA-sgRNA融合策略测试几种高特异性Cas9的编辑效率，对靶向TRY和CPC基因的sgRNA而言，几种高特异性Cas9在T1和T2株系中的编辑效率最高分别为<1%和24%，而野生型Cas9的编辑效率分别为17%和38%；对靶向BRI1基因的sgRNA而言，几种高特异性Cas9在T1和T2株系中的编辑效率最高分别为0%和51%，而野生型Cas9的编辑效率分别为12%和57%，表明Cas9的特异性和编辑效率之间存在相互制衡关系，更高的特异性以牺牲编辑效率为代价。认识到这种制衡关系的意义就在于当我们选择最适合的基因组编辑策略或者开发新的工具时，应当充分考虑这种制衡关系。例如，我们可以在不影响编辑效率的情况下通过选择高特异性靶点等其他措施来提高特异性。

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