内质网与反式高尔基体网络动态相互作用调控葡糖神经酰胺转运的分子机制

The dynamic interaction between two organelles within a certain spatio-temporal range mediates the exchange of material and information in mammalian cell. Lipid transfer protein regulates the non-vesicular trafficking of the specific lipid species at membrane contact sites (MCSs) resulted from the interaction between two adjacent organelles. FAPP2, a phosphatidlinositol- 4- phosphate adaptor protein, locates at trans-Golgi netwok (TGN) and functions as a lipid transfer protein to transfer glucosylceramide to the trans-side of the Golgi complex, where it is further transported into the lumen of the Golgi complex and transformed into complex glycosphingolipids. However, for a long time, the molecular mechanism for glucosylceramide translocation into the lumen of the trans-Golgi remains unknown. In this proposal, we will prepare proteoliposome to reconstitute the interaction between ER and TGN in vitro, and observe the interaction within the living cell with super-high resolution microscope. Furthermore, we will combine cell biology, biophysics and lipidomics to explore the molecular mechanism of the ER-TGN MCSs formation and GlcCer translocation into ER. In addition, we will explore functions of FAPP2 and ACBD3 to regulate autophagy induced by changes of GlcCer level. Hopefully, the production from this proposal will enrich molecular mechanism of lipid vectorial delivery.

细胞内相邻两细胞器在一定时空范围内的动态作用可介导物质和信息交流。脂转运蛋白可在相邻细胞器相互作用形成的膜接触点调控特异的脂类分子的非囊泡转运。定位于反式高尔基体网络的磷酸肌醇-4-磷酸接头蛋白FAPP2负责将葡糖神经酰胺从顺式高尔基体转运到反式高尔基体，但是葡糖神经酰胺必须进一步到达高尔基体膜腔才被修饰为复杂糖鞘脂。目前，关于葡糖神经酰胺进入高尔基体膜腔的分子机制仍不清晰。本项目中我们将体外重建ER与TGN间的相互作用，并运用超高分辨率显微镜观察它们在活细胞内的相互作用，进一步将综合细胞生物学、生物物理和脂组学的方法阐明FAPP2参与ER-TGN膜接触点形成及其介导葡糖神经酰胺进入内质网的分子机制。此外，我们将进一步探索FAPP2调控葡糖神经酰胺水平异常导致发生细胞自噬的分子机制。本项目的实施将丰富脂类分子定向转运的分子机制。

内质网与反式高尔基体网络通过动态相互作用而形成的膜接触位点介导了脂质分子在两细胞器间的交换。基于前期工作基础，本课题围绕定位于高尔基体的脂转运蛋白FAPP2与含有酰基CoA结合结构域3蛋白ACBD3，通过它们间的协同作用，在内质网与反式高尔基体网络膜接触位点进行葡糖神经酰胺转运这一细胞生理活动开展系列研究工作。利用体外表达纯化的mCherry-FAPP2，体外重建了囊泡出芽过程。我们发现，FAPP2通过与内质网膜整合蛋白VAPA相互作用，介导了内质网与反式高尔基体网络膜接触位点的形成；在维持高尔基体形态过程中具有重要作用的ACBD3与脂转运蛋白FAPP2 协同作用，共同担负着转运葡糖神经酰胺的重要使命。在HeLa细胞中敲低ACBD3，可使高尔基体发生片段化，导致定位于TGN的FAPP2 散布于胞质中，从而严重阻碍FAPP2转运葡糖神经酰胺，影响整个糖鞘脂代谢通路。此外，在本项目的支持下，我们揭示了高尔基体蛋白GOLPH3通过调控高尔基体和溶酶体PI4P稳态进而影响mTOR活性和溶酶体功能。这一工作的开展及相关结果将有助于我们深入理解长期存在的GOLPH3如何调控mTOR活性的分子机制这一重要问题，并为相关肿瘤的诊疗以及药物研发提供了新的靶标。

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