利用非整合型农杆菌介导的瞬时转化体系实现植物基因组的高效和精准编辑

Genome editing is a technique used to modify targeted gene loci within a cell using site-specific endonucleases. CRISPR is a type of bacteria-derived non-coding RNA, which can form a complex with Cas9 protein to recoginize and cleave specific DNA sequences. Recently, CRISPR/Cas9 system has been extensively studied and engineered to achieve high-efficient gene editing in plant cells. Hopefully, it will replace the traditional gene mutagenesis and transgene techniques to meet the require of plant genome research and crop breeding. Although in terms of the result, this technique can achieve traceless modification of plant genes， it still cann't completely get rid of the dependence of traditional gene transformation methods during the procedure. We plan to utilize an Agrobacteria strain, which exhibited complete loss of its TDNA integration capablity, to establish a plant transient transformation platform for CRISPR/Cas9 delivery. Meanwhile, we will try optimizing the expressional activity of CRISPR/Cas9 in infected plant cells from both the transcriptional and post-transcriptional level. Our objective is to achieve both high effiicient and precise editing of plant genome without incurring random integration of foreign DNAs.

基因组编辑技术是一项利用具有识别序列特异性的核酸内切酶对目标基因位点进行靶向修饰的技术。CRISPR是一类来源于细菌的非编码的RNA，通过与Cas9蛋白形成复合体来识别和切割特定的DNA序列。近年来的研究表明，经过改造的CRISPR/Cas9系统可以在植物体内实现对靶标基因的高效编辑，从而有望取代经典的基因突变技术和转基因技术来满足植物基因功能研究和作物品种研发的需要。虽然从结果上看，该技术可以实现对植物基因的无痕修饰，但是从过程来看，该技术仍然无法完全摆脱对传统转基因技术的依赖。我们计划利用TDNA整合能力缺失的农杆菌菌株建立一套植物瞬时转化体系用于导入CRISPR/Cas9基因，并尝试从转录和转录后水平上进一步优化CRISPR/Cas9系统在受侵染植物细胞中的表达活性。从而在不引起外源DNA随机插入的前提下，实现针对靶标基因位点的高效和精准编辑。

基因编辑技术是实现农作物定向选育、物种人工驯化和植物工程化改造的有效手段。相比于经典的植物转基因技术，外源DNA序列的随机整合对基因编辑技术而言不仅不是必须的，甚至可能是有害的。但是目前的植物基因编辑技术仍然在很大程度上依赖于农杆菌介导的遗传转化方法来向受体植物细胞递送编码CRISPR/Cas系统的T-DNA序列，并利用随机整合到植物基因组的标记基因来筛选潜在的基因编辑事件。即使后续可以通过自交或杂交的策略去除整合的T-DNA，但仍然无法完全规避由转基因造成的潜在的遗传风险。因此，如何在保证CRISPR/Cas系统的瞬时表达水平的前提下，减少T-DNA的随机整合的几率，提高基因编辑事件的检出几率是本项目的主要研究目标。.为了实现这一目标，本项目从应用和挖掘T-DNA整合能力缺陷的农杆菌菌株入手，通过对vir基因进行定向诱变，我们鉴定到一种未知的C58突变类型，可以在不降低外源基因瞬时表达效率的情况下，将T-DNA的稳定整合效率降低到野生型的60%。在此基础上，我们分别开发了适用于拟南芥和水稻的非整合编辑载体，一方面利用沉默抑制子和表达增强子提高CRISPR/Cas系统的瞬时表达效率；另一方面引入生长调节因子对受侵染的植物细胞进行正反向的差异化筛选。在剔除稳定整合事件的前提下，尽可能富集受农杆菌侵染的细胞。高通量测序结果表明，经过正反向筛选，非整合编辑事件的检出效率有了近10倍的提升。.这一方法的建立，有望直接从转化当代的植物群体中获得不含外源DNA序列的基因编辑材料，极大地降低了纯化基因编辑材料所需的时间和工作量。尤其对培育生活周期长，自交不亲和以及有性繁殖世代短的植物，更是具有重要的实践意义。

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