细菌NADP-依赖性单体与二聚体异柠檬酸脱氢酶之间的分子进化关系

异柠檬酸脱氢酶(IDH)是起源古老、结构保守、功能多元的一大类酶家族，是蛋白质功能演化、线粒体起源及药物开发等研究的最佳模型之一。单体NADP-IDH和二聚体NADP-IDH的氨基酸序列同源性不高，但它们的晶体拓扑结构极其相似，因此提出了单体IDH可能由二聚体IDH的祖先经过结构域融合演化而来的进化假说，但这个假说缺乏实验性证据。本项目期望利用晶体学数据及体外分子定向进化技术，通过模式生物大肠杆菌和枯草杆菌二聚体IDH的结构域融合来构建单体IDH，为进化假说提供更多实验性依据。同时通过单体IDH的结构域倍增、插入等机制，以获得二聚体IDH，追溯单体IDH的祖先蛋白。再通过染色体同源重组构建包含链霉菌单体IDH基因的大肠杆菌菌株，根据重组菌株在贫瘠碳源上的生长情况，来检测单体IDH能否具有二聚体IDH在乙醛酸旁路中的调节功能，为探索细菌单体IDH和二聚体IDH的分子进化关系提供更多依据。

尽管单体异柠檬酸脱氢酶(IDH)与二聚体IDH的序列一致性不高，但活性位点的氨基酸高度保守，且晶体折叠拓扑结构极其相似。因此提出了单体IDH可能由二聚体IDH经过基因的倍增、置换、插入或删除演化而来的假说，但需要实验性数据支持。.以染色体步移法克隆淀粉酶链霉菌IDH (SdIDH) 基因。SdIDH为80 kDa单体IDH，对NADP+的专一性是其对NAD+的18,700倍(Mn2+)和31,800倍(Mg2+)。变铅青链霉菌单体IDH(SlIDH)的晶体结构被解析，分辨率为2.9 Å。新建的IDH系统发生树显示，该家族可分为 Type I、Type II及单体三个亚族，且包含4个新进化分支。3个亚族都包含了具有古老表型的NAD-IDH及其演化而来的NADP-IDH。IDH家族的系统分类补充完整。.4轮随机突变和筛选后获得MonoIDH8。MALDI-TOF/TOF质谱等实验显示，MonoIDH8为约66.8 kDa的单体酶。在Mg2+条件下，MonoIDH8对NADP+的亲和力与E. coli 二聚体NADP-IDH (EcIDH)接近；在Mn2+条件下，MonoIDH8对NADP+和ICT的转换数分别达到EcIDH的57%和58%。MonoIDH8对NADP+的催化效率和野油菜黄单胞菌单体IDH相当，其对ICT的催化效率是北极耐冷细菌单体IDH的1.7倍。因此EcIDH已成功转变为有活性的单体NADP-IDH。通过打断、删除、随机突变和筛选，获得由单体SlIDH改造而来的酶。分子筛层析显示SlIDHα主要以二聚体形式存在，但没有活性，需进一步改造。基于二聚体和单体NADP-IDH之间的相互转换，进化路径可能为：(1)二聚体NAD-IDH进化为单体NAD-IDH，后者的辅酶特异性再向NADP+转变；(2)二聚体NAD-IDH演化为二聚体NADP-IDH，后者再进化为单体NADP-IDH。.通过同源重组构建包含单体IDH的重组菌株。在葡萄糖或乙酸中，重组菌株都能生长。在乙酸中时，包含单体NADP-IDH菌株的IDH比活力升高了3倍，其它菌株都下降了，可能是NADPH需求导致的选择结果。所有菌株的ICL比活力都提高了，野生型菌株提高最显著，可能是其IDH磷酸化作用及乙醛酸旁路的启动更有效。单体IDH在TCA循环中也能发挥类似EcIDH的功能，但需要进一步深入研究。

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