靶向GPcl的新型小分子埃博拉病毒进入抑制剂EEI-10的结构优化及作用机制研究

Ebola virus (EBOV) causes fatal hemorrhagic fever with high death rates in human. Currently, there are no available clinically-approved prophylactic or therapeutic treatments. The recently solved crystal structure of cleavage-primed EBOV glycoprotein (GPcl) in complex with the C domain of endosomal protein Niemann-Pick C1 (NPC1) provides a new target for the development of EBOV entry inhibitors. Small molecules that can effectively block this virus-host interaction would have the potential to be developed into effective drugs. In preliminary work, a computational approach using docking and molecular dynamic simulations is carried out for the rational design of small molecular inhibitors. A novel EEI-10 was identified to target at the late stage of EBOV entry and exhibit specific inhibitory activity against EBOV, with 50% inhibitory concentration (IC50) of 0.49 μM. EEI-10 is a good starting point for designing more powerful small molecule inhibitors. Based on those preliminary results, in this proposal, 1) Identification and optimization of a series of EEI-10 derived molecules targeting the GPcl protein; 2) Analysis of the leads’ anti-EBOV activity revealed from the molecular basis of target protein and virus invasion；3) Investigation of the binding characteristic and molecular mechanism of the active compounds. This study demonstrates the feasibility of inhibiting EBOV entry by targeting GPcl with small molecules, and would promote the basic research on the mechanism of EBOV entry.

埃博拉病毒（EBOV）是导致埃博拉出血热的高致死性病原体，临床上尚无特异性治疗药物。EBOV包膜糖蛋白GPcl与宿主细胞内吞体受体NPC1之间的相互作用在介导病毒入侵过程中起着关键作用，成为EBOV进入抑制剂的新靶点。本课题前期以此为靶点开展了虚拟筛选，获得了结构新颖的小分子EBOV进入抑制剂EEI-10，可特异性抑制EBOV重组病毒的感染（EC50=0.49μM）。本项目拟1）通过分子对接等技术手段，构建构效关系模型，开展EEI-10的结构优化研究；2）从靶分子和病毒入侵两个角度上分析小分子的抗EBOV活性、选择性以及作用环节；3）探究活性小分子与靶蛋白的结合模式和作用机制。该项目将为从化学生物学角度深入解析EBOV进入机制挖掘理想的分子探针，同时验证靶向GPcl与NPC1-C相互作用发展抗EBOV药物的可行性，推动新药研发展。

埃博拉病毒（EBOV）是导致埃博拉出血热的高致死性病原体，临床上尚无特异性治疗药物。EBOV包膜糖蛋白GPcl与宿主细胞内吞体受体NPC1之间的相互作用在介导病毒入侵过程中起着关键作用，成为EBOV进入抑制剂的新靶点。我们前期根据EBOV-GPcl与NPC1之间的相互作用，通过基于结构的虚拟筛选方法获得了一个活性小分子EEI-10。在本项目的实施过程中，我们设计并合成了一系列EEI-10衍生物，并对这些化合物的抗病毒活性以及作用机制进行了深入研究。重要结果和关键数据如下：.1）在EEI-10与EBOV-GPcl结合模式的基础上，我们设计并合成了9个EEI-10衍生物，结果表明这些化合物对EBOV病毒的进入均有显著的抑制作用；.2）苗头化合物EEI-10可以在细胞水平（Vero E6 细胞）抑制EBOV活毒的感染，EC50=4.1 μM。最重要的是，EEI-10可以保护小鼠免受致命性EBOV的感染，具有发展成为抗EBOV药物的巨大潜力；.3）苗头化合物EEI-10可抑制MARV和LASV进入宿主细胞，EC50分别为0.99 μM和2.64 μM，具有广谱抗出血热病毒活性；.4）体外结合实验表明EEI-10能够与EBOV–GPcl蛋白结合，氨基酸点突变实验进一步验证了EEI-10与包括I113在内的氨基酸具有直接相互作用；.5）EEI-10的存在可显著减少EBOVpp颗粒与NPC1在感染细胞中的共定位。EEI-10通过阻断GPcl与NPC1之间的相互作用来抑制病毒和细胞膜的融合过程；.6）EEI-10的Cmax 和AUC0-24h分别为1.03 μM和12.5 μM.h。此外，EEI-10对小鼠的急性毒性较低，LD50 值为1.7±0.2 g/kg。EEI-10的药代动力学数据为后续的临床前研究提供研究基础。. 随着经济全球化的发展，埃博拉疫情成为成为全球大流行病的风险已大大增加。缺乏有效和低成本的特效药物是全球埃博拉药物市场的主要驱动力。疫情的频繁爆发也促使我国加速了相关药物的研发和审批速度。我们的研究表明，EEI-10（盐酸小檗胺）在体外和体内均能有效抑制EBOV的感染。更重要的是，由于盐酸小檗胺在已经在临床上被批准用于治疗白细胞减少症，因此有望通过药物再利用的方式发展成为抗EBOV药物。

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