基于高通量筛选的有机磷酯水解酶OPHC2进化历程研究

As an organophosphate hydrolase, OPHC2, which has been identified in many organophosphate-resistant bacteria, can catalyze the degradation of methyl-parathion with moderate activity and high thermostability. However, to date, the ancestral enzyme of OPHC2 and its evolutionary trajectory remains obscure. The object of this project is to develop a droplet-based high-throughput cell acclimation and screening method for studying the evolutionary trajectory of OPHC2 in certain bacteria. According to the object, we are going to design and optimize a new technique by which high organophosphate-resistant strains can be enriched automatically via cell encapsulation-growth-encapsulation. We will use this method to obtain a huge number of samples efficiently for analysis, set up a database of key amino acid mutations by gene sequencing, homology modelling and site-directed saturation mutagenesis, and construct the evolutionary trajectory in certain bacteria by comparing the results of microbial acclimation with the database. The structure-function relationship of OPHC2 will be further clarified through this project, which can provide solid theoretic guidance for engineering organophosphate hydrolases with high catalytic performance.

作为一种可降解甲基对硫磷的水解酶，OPHC2具有中等的催化活性和良好的热稳定性，存在于许多具有有机磷酯抗性的细菌中。然而，目前人们对OPHC2从何种“祖先酶”、如何进化而来还知之甚少。本项目旨在通过发展基于微液滴的高通量菌种驯化及筛选方法，研究特定细菌中从祖先酶到OPHC2的进化路径。围绕目标拟设计和优化新型的细胞分装-增长-分装的技术方法，将具有有机磷酯耐受性的菌种自动富集起来，从而快速高效获取大量的进化样本加以分析；通过基因测序、同源建模、定点饱和突变等工具建立关键氨基酸突变的数据库，并对比环境微生物的人工驯化的氨基酸突变结果，构建出特定细菌中OPHC2的进化历程。通过项目实施，将进一步澄清有机磷酯水解酶OPHC2的构效关系，为分子改造提供有力的理论指导。

有机磷化合物在环境中的积累导致了严重的食品安全和环境污染问题，受到全球的广泛关切。有机磷生物降解具有反应速度高和环境友好等优点，是目前的研究热点。内酯酶OPHC2可降解甲基对硫磷，具有中等的催化活性、良好的热稳定性和较强的催化混乱性，存在于许多有机磷酯抗性的细菌中。然而，OPHC2催化混乱性的分子机制尚不清楚，从内酯酶到有机磷水解酶催化功能转化的进化历程知之甚少，阻碍了有机磷水解酶的催化功能研究和工程应用开发。. 本项目针对上述科学问题，发展了菌种高通量驯化和有机磷水解酶高通量定向进化的研究方法，单细胞筛选频率达到10^4，有机磷农药检测灵敏度达到0.1μM，显著提高了酶进化历程研究的效率；系统研究了从OPHC2到一系列高活力有机磷水解酶的进化历程，解析了关键突变体的晶体结构，揭示了活性中心酶与底物的相互作用对酶催化活力、选择性和稳定性的影响，从分子层面上解释了OPHC2催化混乱性的结构基础。在此基础上，创制了马拉硫磷水解酶PoOPHM9、甲级对硫磷水解酶BjMPHT64N、有机磷阻燃剂水解酶PoOPHV5，开发了无甲醇诱导毕赤酵母体外分泌表达有机磷水解酶的高收率发酵技术，时空产率达到640 UL-1h-1，为目前报道的最高值；开发了聚醚Pluronic F127-有机磷水解酶的无载体固定化技术，最适反应温度从30℃提高到50℃，50℃半衰期从7.2 h提高到12.8 h，在多种类型的去污剂存在下催化活力提高了2-2.5倍，适用于高温、高表面活性剂浓度等苛刻的工业应用条件。. 本项目顺利完成了预定的研究目标，形成了从蛋白质进化历程的基础研究到有机磷水解酶工程应用的系统性创新成果，共发表标注项目号的研究论文9篇（JCR1区论文2篇）；申请中国发明专利3项，授权中国发明专利1项；在国内外重要会议发表报告3次；培养博士毕业生1名，硕士毕业生4名，其中1人获研究生国家奖学金，2人获国家留学基金委全额奖学金。本项目的实施为有机磷水解酶低成本工业化应用打下良好基础，形成的技术成果有望应用于食品安全、生态修复、废水处理等领域。.

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