基于结构和进化信息的间位开环产物水解酶半理性设计

Meta-Cleavage product (MCP) hydrolases exist widely in various aerobic metabolic pathways of aromatic compounds. Due to the strict substrate selectivity, MCP hydrolase often becomes the rate-limiting enzyme of the whole pathway. Meanwhile, the low active C-C bond hydrolytic reaction is a rare enzymatic reaction, thus understanding the nature of MCP hydrolase catalyzed reaction is important. This project will explore the function origin of C-C bond hydrolysis, molecular evolution of MCP hydrolase, and key residues which determining substrate selectivity/catalytic efficiency. Firstly, ancestral sequence reconstruction, molecular dynamics and de novo design are employed to give clues to the important residues. Then, total gene synthesis and steady/non-steady state kinetics will be used to validate and characterize those semi-rational designed mutants. The aims of this project are to obtain beneficial mutants exhibiting high catalytic efficiencies, and expand our understanding on the structure-function relationship of MCP hydrolase.

间位开环产物水解酶广泛存在于多种芳香化合物好氧降解的间位断裂途径中，由于自身严格的底物选择性，使其成为整条代谢途径中的限速酶。同时，该酶催化的低活性C-C键水解断裂反应从化学本质上而言较为罕见，具有重要的理论研究价值。本项目拟利用间位开环产物水解酶的序列信息和结构信息，探究C-C键断裂功能的起源、水解酶的进化过程以及决定底物选择性和催化效率的关键氨基酸位点。首先,通过祖先序列重构、分子动力学模拟以及从头设计方法获取理论突变体（半理性设计）。随后,结合全基因合成及稳态/非稳态动力学方法对半理性设计的突变酶特性进行验证。本课题的目的在于获得催化性能改善的突变体，并加深对间位开环产物水解酶的结构-功能关系的理解。

在本项目的资助下，主要开展了以下三个方面的研究。(1) 利用C-C键水解酶的“C-O键水解”的催化混杂性，水解Ti-BALDH合成TiO2/NaTi2(PO4)3复合材料。该材料具有优于商用TiO2 (P25)的光催化活性，可在40 min内还原10 mg L-1的亚甲基蓝。（2）利用分子动力学模拟研究了C-C键水解酶不同家族的底物通道情况，确定了不同家族之间的保守通道残基，并通过定点突变等手段，以来源于菌株LA-4中的BphD为研究对象，进行了酶学特性的验证。通过实验结果，确定了Leu213和Phe157对决定底物特异性具有重要的作用。(3) 利用从头预测软件Evodesign，理性设计了一个C-C键水解酶，并通过直接合成DNA，并在大肠杆菌中异源表达验证其催化活性。结果表明合成的蛋白质可以正确折叠，但是其催化活性较低，需要经过进一步定点突变优化。

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