基于多基因共表达载体的通用型流感疫苗研究

Influenza pandemic poses a serious threat to human public health, causing heavy losses to the global economy. Due to the low protective efficacy and high development costs of current influenza vaccine, development of an efficient, universal influenza vaccine is imminent. The growing body of research shows that a universal influenza vaccine will become possible. This new kind of vaccine will not only promote the basic research of the vaccine at the same time will enhance the entire vaccine industry, bringing enormous social and economic benefits. Building on previous results detailed in the application, we are proposing to develop a multigene expression vector based on chimpanzee-derived replication defective adenovirus vectors, AdC68, which expresses neutralizing antibody epitopes of HA stalk within variable regions of hexon, and nucleoprotein (NP) for induction of T cell responses within the vector deleted E1 domain, and matrix-2 ectodomain (M2e) for induction of non-neutralizing protective antibody within the vector deleted E3 domain. The neutralizing epitope within HA stalk is located within a highly conserved helical region in the membrane eproximal stems of HA1 and HA2. A highly structured discontinuous sequence cannot be displayed by a short peptide delineated from this sequence. We will therefore use phage peptide display library to identify suitable HA stalk mimotopes. Four mimotopes upon initial in vitro and in vivo testing will be incorporated into VR1-VR4 of hexon. Vectors once constructed and quality controlled will undergo a series of immunogenicity and efficacy tests in mice and ferrets. Through accomplishing this project, a highly efficient universal influenza vaccine and a novel vaccine development platform will be developed.

流感流行对人类公共卫生与健康构成严重威胁，给全球经济造成重大损失。针对现有流感疫苗保护效果差、研制成本高等问题，研发新型通用型流感疫苗迫在眉睫。越来越多的研究表明，通用型流感疫苗将成为可能。本项目将在已有工作基础上，构建新型腺病毒AdC68多基因共表达载体，同时用噬菌体随机肽库筛选流感HA stalk的模拟表位，然后将免疫原性最强的模拟表位展示于AdC68 Hexon可变区，将 NP（H1N1）基因克隆至AdC68 E1缺失区,并将多个M2e(H1N1,H2N2,H3N2,H5N1,H7N2)克隆至AdC68 E3缺失区，获表达流感病毒多个抗原基因和表位的重组腺病毒。候选疫苗将在小鼠、雪貂等动物中检测免疫反应与免疫保护效果，探讨诱导广谱免疫反应的机制。期望获得一种新型、高效的通用型流感疫苗和一种新型载体平台，并阐明新型通用流感疫苗的免疫保护机制，为新型疫苗研究提供科学依据。

流感病毒传播广泛、变异迅速，是人类健康的严重威胁，并且给全球经济造成重大损失。针对现有流感疫苗保护效果差、研制成本高等问题，研发通用型流感疫苗迫在眉睫。因此，我们拟利用黑猩猩型腺病毒构建新型疫苗载体平台，研发高效的新型广谱流感疫苗。. 通过本项目实施，我们成功构建了E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒载体AdC68，在其E1、E3删除区可以分别插入不同的外源基因表达框，并可在该腺病毒结构蛋白Hexon或Fiber展示外源基因或抗原表位。因此，我们成功获得了基于腺病毒AdC68的多基因共表达载体，为新型疫苗研发提供有力的技术保障。在此过程中，我们还创建了一种构建重组腺病毒载体的快速、高效的新方法，即腺病毒载体等温重组法，该方法是重组腺病毒分子克隆中重要的技术革新。. 为顺利完成本项目中预定的研究任务，我们利用新型腺病毒载体AdC68设计多价流感疫苗。策略之一是建立以AdC68 Fiber为基础的疫苗研发平台，使其HI loop容纳外源基因的大小可达225bp。以此为基础，我们成功获得了Fiber展示H1N1、H5N1、H7N2三种毒株M2e的重组腺病毒，即AdC68-F3M2e。该重组腺病毒免疫动物后，可诱导特异性抗体反应，有效拮抗致死剂量的H1N1、H5N1、H9N2等流感病毒的攻击感染。此外，我们还比较了H1N1、H5N1、H7N2等三种毒株的M2e以不同排列顺序在Fiber展示后的免疫原性，并探讨产生免疫原性差异的机理。因此，该研究结果显示，腺病毒Fiber展示技术可作为新型疫苗的研发平台。策略之二是筛选具有抑制流感病毒复制能力的microRNA并以AdC68作为转运载体，以此作为一种新颖广谱的抗流感策略，该研究结果证明靶向流感保守基因NP和M的miRNA可作为流感防控的新手段。在本项目部分资助下，我们研发基于黑猩猩腺病毒载体的新型H7N9疫苗和H5N1疫苗，即以重组腺病毒载体表达相应的HA蛋白，免疫小鼠一次，即可获得100%的免疫保护效果。研究证明：HA特异性T细胞免疫和抗体反应对保护效果都有重要贡献。. 综上，我们顺利完成了本项目的研究任务，实现了研究目标，为新型腺病毒载体的构建以及通用流感疫苗的研发提供了新策略和科学依据。

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