生长素介导WOX调控百合胚性细胞形成的分子机理

Lily is the famous bulbous ornamental plants and economic crops in the world. Somatic embryogenesis is the most promising regeneration pathway to solve problems of bulb production, germplasm preservation and genetic improvement in Lilium. So far, the mechanism of somatic embryogenesis in various plants has not been fully elucidated. In our previous work, the origin style of somatic embryogenesis, the time node at which embryonic cells appear had already been clarified, and the essential role of auxin on the initiation of somatic embryogenic process was preliminary confirmed in Lilium pumilum. In this study, we focus on the embryogenic property acquisition of somatic cell at the very early stage of embryogenesis and take the WOX protein, the homeobox protein of WUSCHEL usually been regarded as early marker of the appearance of embryonic cells, as the study entry point, trying to reveal the key role of WOX in embryogenic cell formation of lily induced by auxin. Further, the possible interaction between ARF protein, the key regulatory factor in auxin signaling pathway, and target WOX will be explored, thus may reveal the upstream regulation of ARF protein on WOX in lily embryogenic cell formation induced by auxin. The results of this study will lay a theoretical foundation for the systematic study of the molecular mechanism about somatic embryogenesis in Lilium and provide research ideas for the study of somatic embryogenesis in other plants.

百合是世界范围内的著名球根类观赏植物和经济作物。体细胞胚发生是最有希望解决百合种球培育、种质保存和遗传性状改良等问题的重要再生途径。目前植物体细胞胚的发生机制尚未得到全面阐述。本研究在明确百合体细胞胚起源方式、胚性细胞出现的时间节点，并初步证实生长素对体细胞胚性程序启动的先决作用的基础上，聚焦于体细胞胚发生初期体细胞胚性获得这一关键环节，以胚性细胞出现的早期标志WUSCHEL蛋白的同源框蛋白WOX为切入点，揭示WOX在生长素介导百合胚性细胞形成中的关键作用；进一步通过探究生长素信号通路上关键调控因子ARF蛋白与目标WOX间可能的互作关系，试阐释在生长素诱导百合胚性细胞形成中ARF蛋白对WOX的上游调控作用。研究结果将为系统深入研究百合体细胞胚发生的分子机制奠定理论基础，并为其他植物的体细胞胚发生研究提供研究思路。

体细胞胚发生作为一种再生方式具有遗传稳定性高、诱导周期短、繁殖系数高等优点，基于体细胞胚发生的百合鳞茎繁殖、资源保存与遗传性状改良等对百合产业发展具有重要意义。植物体胚发生的分子机制尚未得到全面解析。目前已知WOX家族基因在细胞分裂分化及干细胞稳定性维持方面重要作用，但WOX是否直接调控体胚再生尚不明确。WOX与生长素通路关键响应因子ARF的关系尚未见报道。本项目聚焦于百合体细胞胚性获得这一关键节点，借助第三代全长转录组测序、染色体步移、亚细胞定位、酵母单杂交、酵母双杂交、基因过表达和CRISPR/Cas9基因编辑等技术手段，研究了WOX在外源生长素PIC诱导百合胚性细胞形成中的调控作用。主要结论如下：1.外源生长素类物质PIC诱导3d即可使外植体获得体细胞胚发生能力，第9天形成胚性细胞团，生长素运输抑制剂TIBA可以显著抑制胚性细胞形成，说明外源PIC诱导是百合体细胞胚性获得的必要条件。2.LpWOX9、LpWOX13以及LpARF2、LpARF3、LpARF7、LpARF12、LpARF15和LpARF19在百合体胚诱导初期显著差异表达，表明生长素信号通路及WOX家族基因在百合胚性细胞形成过程中发挥重要作用。3.通过酵母双杂交研究证实LpARF19与LpWOX9在蛋白水平互作，参与生长素介导的百合体胚发生。4.LpARF7、LpARF15和LpARF19均能够结合LpWOX9和LpWOX13启动子，在转录水平调控WOX表达进而影响百合胚性细胞形成。5.长素运输相关基因LpABCB21和LpPILS7在体细胞胚发生过程中显著差异表达，LpABCB21能够调控体细胞胚的早期形成，LpPILS7主要调控体细胞胚诱导效率。本研究初步探明了外源生长素PIC通过下游响应因子ARF蛋白实现对WOX基因表达的直接调控，进而对百合胚性细胞形成发挥调控作用。本研究结果为揭示百合体细胞胚性获得的分子机制奠定了基础，为丰富植物细胞全能性研究提供了理论依据。

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