β-内酰胺类抗生素通过SarA调控MRSA串联脂蛋白表达的作用与机制研究

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most important pathogens in clinic, and is resistant to β-lactam antibiotics. However, as the most experience medication in hospital, β-lactam antibiotics can’t kill MRSA and may aggravate MRSA infections through inducing certain kinds of virulence factors, which are being worth of high attention. We previously found that the treatment of MRSA strain N315 with oxacillin can up-regulate the expression of Tandem lipoproteins (Tlpp), and promote the production of proinflammatory cytokines in macrophage RAW264.7 cells. The mechanisms underlying this phenomenon are unclear. It has been reported that β-lactam antibiotics can induce the expression of a regulator SarA in MRSA. Bioinformatics analysis revealed there is a putative SarA binding site on the promoter region of MRSA tlpp gene. Therefore, we suppose that β-lactam antibiotics up-regulate the expression of Tlpp in MRSA through the control of SarA. To test this hypothesis, this project aims to reveal the effect of SarA on the expression of Tlpp in MRSA. The regulatory function of SarA on tlpp will be investigated based on sarA gene knock-out and complement strains. The mechanisms by which β-lactam antibiotics up-regulate Tlpp through SarA will be determined by the lacZ reporting, EMSA, and binding site mutation experiments. The functions of β-lactam-induced Tlpp in MRSA will also be evaluated using cell and animal models. The elucidation of roles and mechanisms for β-lactam antibiotics to promote MRSA pathogenicity will provide a new theoretical support for reasonable choice of antibiotics to prevent infections caused by MRSA in clinics.

耐甲氧西林金葡菌（MRSA）是临床感染的重要病原菌，对β-内酰胺类抗生素不敏感，但后者作为临床最常用经验用药，不但不能杀灭MRSA，还可能加剧MRSA感染，值得高度关注。我们预实验发现苯唑西林处理可上调MRSA串联脂蛋白Tlpp，促进巨噬细胞炎症因子表达，其机制不清。研究表明，β-内酰胺类抗生素可上调MRSA转录因子SarA表达，课题组分析发现tlpp启动子区含有SarA结合基序，推测β-内酰胺类抗生素通过SarA上调Tlpp的表达，增强MRSA的致病性。为此，本项目拟构建SarA敲除及回补株，检测SarA对抗生素诱导Tlpp表达的影响；通过lacZ报告实验、EMSA及靶序列突变探讨SarA调控Tlpp的机制；再通过细胞和动物实验评价菌株的致病性，阐明β-内酰胺类抗生素通过SarA调控Tlpp表达，增强MRSA致病性的作用与机制，为临床合理选用抗生素有效防控MRSA感染提供新的理论依据。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为临床上分离率最高的革兰阳性菌，对临床常用的β-内酰胺类抗生素均耐药。而临床上β-内酰胺类抗生素常作为革兰阳性菌感染治疗的经验用药，当遇到MRSA感染患者时，β-内酰胺类抗生素不但不能发挥有效的治疗效果，亚抑菌浓度的β-内酰胺类抗生素反而可能促进MRSA毒力基因表达，增强感染的严重性。因此，探索β-内酰胺类抗生素诱导MRSA毒力基因表达的分子机制及其在宿主体内促进MRSA的致病作用，对合理选用抗生素，有效防控MRSA感染具有重要的现实意义。脂蛋白（lipoproteins, Lpps）是锚定于细菌细胞膜上的重要功能蛋白。部分Lpps可分泌到菌体外，与宿主天然免疫细胞表面的TLR2受体结合，激活TLR2依赖的天然免疫反应，诱导宿主炎症反应，增强细菌致病性等。本研究在MRSA基因组中发现了一个受亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素诱导表达的脂蛋白样基因簇（lpl，sa2273-2275）。生物信息学分析发现该基因簇启动子区有一个保守的SarA识别基序，进一步通过LacZ报告系统、EMSA和位点突变实验等明确了SarA对lpl的直接调控作用和机制。β-内酰胺类抗生素诱导的Lpls可刺激RAW264.7巨噬细胞中IL-6和TNF-α的表达。lpl缺失突变体（N315Δlpl和USA300Δlpl）在体外和体内刺激细胞炎症因子表达的能力均显著降低。纯化的脂化SA2275-his蛋白在原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞和C57BL/6小鼠均发挥TLR2依赖的促炎作用。N315Δlpl在感染小鼠肾脏中的细菌载量低于野生型N315。与未处理MRSA相比β-内酰胺类抗生素预处理的MRSA在BALB/c和C57BL/6小鼠中均加剧了感染皮肤的严重性，脓肿显著增大，组织结构严重破坏。但在C57BL/6 TLR2-/-小鼠中，经β-内酰胺类抗生素预处理的N315引起的脓肿大小与未经处理的N315Δlpl引起的脓肿大小无显著差异。研究结果提示，临床上应根据药敏结果选用抗生素，因经验性使用的β-内酰胺类抗生素在遇到MRSA感染情况下，随着药物在患者体内的代谢，亚抑菌浓度的β-内酰胺类抗生素还可能促进Lpls表达从而增强MRSA致病性，加重感染患者的严重性。同时，我们发现SA2275特异抗体可抑制金葡菌所致脑脓肿的形成。因此，脂蛋白可作为疫苗开发的候选对象。

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