基于新一代测序技术的DMD无创产前诊断研究

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most frequent and lethal form of muscular dystrophy. The causative gene DMD is located at Xp21.1 and covers a large genomic size of 2.4Mb, in which many types of mutations involve, however, exon deletions/duplications are found in about 70% of all patients. De novo mutations account for 1/3 of all sporadic patients. Noninvasive prenatal diagnosis for DMD has been a hot issue to be solved in recent years. This proof-of-principle study aims to determine the mutational status of exon deletions/duplications in the DMD fetus from maternal plasma.Targeted exon capture and deep sequencing will be performed on cell-free DNA fragments extracted from maternal plasma using next generation sequencing technology.Comparative analysis of the differences of targeted exon sequencing data between the exon deletions/duplications group and the control will be used to determine the genetic conditions of DMD mutation in fetus and mother, establish different data analysis methods and develop a novel noninvasive prenatal diagnosis for DMD fetus either inherited or caused by de novo exon deletions/duplications mutation.This method can detect > 178bp deletions/duplications within the captured DMD region no matter if the mutation exists or not on the maternal background, and is potentially applicable to non-invasive diagnosis of almost any genetic condition with small deletions/duplications mutation, rather than being limited to specific traits (such as the sex and aneuploidy of the fetus) like most previous methods.

杜氏肌营养不良（DMD）是最常见的致死性肌肉疾病，致病基因DMD位于Xp21.2，全长2.4Mb，突变类型多，外显子缺失/重复突变约占70%,散发病人新发突变占1/3。该病无有效治疗方法，建立无创产前诊断已成为亟待解决的热点问题。本原理论证研究针对遗传和新发DMD基因外显子缺失和重复突变胎儿，用孕妇外周血浆游离DNA为研究材料，通过目标区域捕获和新一代测序技术，进行外显子捕获和高通量测序，比较胎儿外显子缺失/重复组与对照组间目标外显子数据的差异，完成胎儿和孕妇DMD的遗传状态分析，研究不同数据分析方法，建立遗传性和新发性胎儿DMD基因缺失/重复型突变无创产前诊断新方法。实现存在/不存在孕妇DMD基因外显子杂合性缺失/重复突变背景下，检测胎儿DMD基因外显子178bp缺失/重复，该方法可应用于其他携带小片段外显子缺失/重复突变基因的无创产前诊断，不同以往技术仅限于检测胎儿性别或染色体异倍体。

背景.杜氏肌营养不良（DMD）是最常见的致死性肌肉疾病，致病基因 DMD 位于 Xp21.2，全长2.4Mb，突变类型多，外显子缺失/重复突变约占 70%，散发病人新发突变占 1/3。该病无有效治疗方法，建立无创产前诊断已成为亟待解决的热点问题。而目前无创产前检测均基于杂交捕获方法，由于该技术原理上的缺陷，灵敏度相对较低，难以检测在母源变异背景下，因胎源发生变异引起的微量差异。.研究内容.①试图建立基于反向PCR和barcode的环化单分子扩增和重测序技术（cSMART）,可将目标区域cfDNA分子悉数捕获、富集,再通过高通量测序,避免复制错误和偏倚、实现对突变区域单分子的定性和绝对定量。②引入mate pair建库方法和高通量测序平台，开展基因组区域断裂点精确定位方法学的研究，并完成数例DMD家系的断裂点精确定位和验证。③针对大片段区域缺失重复引起的DMD，创新性地提出了先行缺失区域断裂点精确定位，结合断点cSMART检测，通过断裂前后模板数比例的比较，推测出胎儿基因型的方案，并尝试应用于缺失型DMD无创产前检测研究中。.重要结果和关键数据.①发明了高精度、高捕获率、无偏倚进行血浆游离DNA扩增的cSMART方法，达到仅需抽取孕妇外周血就能检测出胎儿特定位点是否发生突变的目标，完成了多个常见单基因病临床样本的试验，与常规产前检测结果具有较高的一致率。②针对缺失型DMD无创产前检测，提出先进行断裂点精确定位，再使用cSMART方法检测断裂缺失前后模板数差异的策略。③建立了基于mate pair方法的基因组结构变异精确定位方法，并应用于DMD缺失样本断裂点定位研究中。.科学意义.发明了基于循环单分子扩增和重测序技术（cSMART），被国际同行誉为“分子诊断的革命性突破”，并引起了产业界的高度关注。完成在DMD、PKU、SMA和地中海贫血等遗传病无创产前检测，结果表明可用于其它遗传单基因病的无创产前诊断，复合准确度高于99%，灵敏度高达1/10000。且在肿瘤早期诊断具有更广泛的应用前景，可以准确定量血液中低水平的肿瘤特异性循环DNA和用于监测病人对治疗的反应。建立Mate pair高通量测序进行全基因组结构变异定位方法，可用于结构变异导致染色体断裂重组引起的遗传病致病位点的寻找及机制的研究，有助于发现或克隆新的致病基因。

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