对映-贝壳杉烷二萜靶向抑制细胞角蛋白纤维组装及其机制的研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31660101
项目类别：
地区科学基金项目
资助金额：
40.0万
负责人：
丁兰
依托单位：
西北师范大学
学科分类：
C0209.植物化学
结题年份：
2020
批准年份：
2016
项目状态：
已结题
起止时间：
2017-01-01 至2020-12-31

项目参与者：
刘国安；张会；杨红；陈宗儒；魏婧昕；刘扬；薛莹；李佩蔚；李昊聪；
关键词：
角蛋白纤维细胞骨架中间纤维对映-贝壳杉烷二萜化学抑制剂

项目摘要

Intermediate filaments (IFs) is one of the three kinds of cytoskeleton in higher eukaryotes. Keratins represent the largest subfamily of IF proteins and its function to resist mechanical stretch, maintain the cell and tissue integrity have been clearly identified. A growing number of evidences have showed that keratin filaments were deeply involved in the regulation of protein synthesis, signaling function,cell proliferation, cell differentiation, apoptosis, cell stress and other life processes, but its corresponding mechanism is still unclear, which greatly hindered the deeper exposition of these important life processes, mainly due to very few of the available inhibitors specific compounds of keratin filaments has not been found. In this study, cell culture, immunofluorescence and laser confocal microscopy techniques are used to build a cell model in order to study assembly inhibition and depolymerization effects of ent-kaurane diterpenoids, with different molecular skeleton type, on keratin filaments; in addition, tandem mass spectrometry, fluorescence spectrum and circular dichroism technology are used to study the mechanism of ssembly inhibition and depolymerization caused by target compounds, so that to obtain significant keratin filaments inhibitors.

中等纤维是高等真核生物的三种细胞骨架之一，角蛋白纤维是中等纤维中最重要的一类，它最明确的功能是抵御机械伸拉，维持细胞及组织的完整性。越来越多的证据显示它们深度参与了调控细胞蛋白质合成、信号传导、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡以及细胞胁迫等生命过程，但其机制完全不清，极大地阻碍了这些重大生命过程的深入阐释。究其原因，主要因为迄今尚未发现可用于角蛋白纤维功能研究的特异性化学抑制剂。本研究旨在利用细胞培养、免疫荧光和激光共聚焦技术，建立细胞研究模型，研究不同分子骨架类型的对映-贝壳杉烷二萜对上皮细胞角蛋白纤维的组装抑制和解聚作用，进一步利用串联质谱技术、荧光光谱及圆二色谱技术研究目标化合物对角蛋白纤维的组装抑制和解聚机制，并在此基础上获得具有显著效应的角蛋白纤维抑制剂。

结项摘要

本研究从甘肃产香茶菜植物的叶中分离得到10种对映-贝壳杉烷二萜。通过建立全细胞筛选模型结合免疫荧光图像分析，以及亲和柱层析、质谱和荧光光谱等，确定了对映-贝壳杉烷二萜的全新的分子靶标，即，角蛋白。免疫荧光技术显示，候选化合物（leukamenin E和weisiensin B）在亚细胞毒性条件下可明显阻滞铺展中细胞角蛋白纤维的重组装，并显著减少已铺展细胞内角蛋白纤维的数量，该效应与细胞内微丝和微管的解聚无关。采用western blotting技术验证，发现细胞经候选化合物处理后其提取液的上清液中可溶性角蛋白增加，而提取液沉淀中的非可溶性角蛋白下降，但细胞中角蛋白表达水平并不被改变，证实了候选化合物对细胞角蛋白的组装抑制效应。此外，还观察到候选化合物显著减少Hacat细胞K14多聚纤维的二硫键，导致K14纤维网络的组装抑制。进一步合成探针分子Biotin-PEG-COOH -weisiensin B（BPW）并钓取weisiensin B在胞内的靶标蛋白，通过亲和柱层析分离纯化胞质蛋白并用K14抗体识别，发现weisiensin B可与胞内角蛋白K14结合，证实weisiensin B与角蛋白K14有直接靶向连接；MS谱分析显示，leukamenin E可与基于K1和K10序列合成的多肽共价连接；紫外和荧光光谱分析leukamenin E和角蛋白混合物，显示leukamenin E能与角蛋白相互作用形成新复合物；此外，我们还发现leukamenin E可通过ERK信号途径刺激角蛋白K8-Ser52以及K18-Ser431/Ser73的磷酸化升高进而抑制角蛋白纤维组装。上述结果表明，候选化合物可通过2种机制共同作用于角蛋白，即，与角蛋白直接靶向连接以及诱导角蛋白磷酸化，进而抑制细胞内角蛋白纤维组装。高活性的该类二萜对于角蛋白纤维组装的机制、角蛋白纤维的细胞功能的研究以及抗肿瘤药物的研发有重要价值。