α7nAChR作为异欧前胡素抗炎、镇痛药理作用新靶点的研究

To elucidate the analgesic and anti-inflammatory pharmacodynamics basis of traditional Chinese medicine Angelica, and make a further study of its pharmacological mechanism on the analgesic and anti-inflammatory effects, our previous studies have applied the comprehensive two-dimensional (2D) cell membrane chromatography analysis system and screened out the Isoimperatorin, which is selected to be the representative effective component of Angelica from total extract of Radix Angelicae dahuricae. By drug affinity responsive target stablitity (DARTS) et al, α7nAChR have been found to be the binding protein of Isoimperatorin. Becuase α7nAChR is significant in the treatment of inflammation and pain based on mediating cholinergic anti-inflammatory pathway, we deem that α7nAChR is the target protein of Isoimperatorin.To confirm the drug-target protein interaction, surface plasmon resonance(SPR) will be used in this study to detect the binding relationship between α7nAChR and Isoimperatorin, Moreover, RNA interference (RNAi), selective α7nAChR antagonist and α7nAChR knockout mouse will be applied in-vivo and in-vitro experiments to verify that α7nAChR mediates the analgesic and anti-inflammatory actions of Isoimperatorin. It is hope that this study could provide experimental and theoretical basis to reveal the pharmacodynamics basis of traditional Chinese medicine Angelica, and make a preliminary elucidation of the pharmacological mechanisms from target protein level.

为了明确中药白芷镇痛、抗炎作用的药效物质基础，并深入研究白芷的药理作用机制，本项目在前期研究中利用全二维细胞膜色谱分析系统，筛选出中药白芷抗炎、镇痛药理活性的代表成分异欧前胡素；通过药物亲和反应靶标稳定技术等，发现异欧前胡素能特异性的结合尼古丁受体α7（α7nAChR）。鉴于α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路对于炎症、疼痛的治疗具有重要意义，我们认为α7nAChR很可能是异欧前胡素的药理作用新靶点。为了验证α7nAChR为异欧前胡素的靶蛋白，本项目拟采用表面等离子共振分析技术（SPR）检测两者的结合解离情况；采用RNA干扰技术、α7nAChR的特异性阻断剂和基因敲除小鼠等，在体外和体内抗炎、镇痛实验中，验证异欧前胡素通过靶向结合α7nAChR发挥药效。本研究为揭示中药白芷镇痛、抗炎活性的物质基础，从靶标蛋白水平初步阐明其作用机制提供实验基础和理论依据。

为明确中药白芷镇痛、抗炎作用的药效物质基础，本项目利用全二维细胞膜色谱分析系统，筛选出中药白芷抗炎、镇痛药理活性的代表成分异欧前胡素；并通过药物亲和反应靶标稳定技术等，发现异欧前胡素能特异性的结合尼古丁受体α7（α7nAChR）。为了进一步验证α7nAChR为异欧前胡素的靶蛋白，本项目首先采用表面等离子共振分析技术，检测得到两者的结合解离常数Kd为 13.4μM。ELISA技术检测发现异偶前胡素抑制LPS刺激下巨噬细胞RAW264.7释放炎症因子IL-6，TNF-a等的作用能被α7nAChR特异性阻断剂甲基牛扁碱有效阻断；采用RNA干扰技术沉默α7nAChR 基因表达后，发现异欧前胡素对促炎因子IL-6、TNF-α的下调作用，以及抑炎因子IL-10的上调效应显著降低，进一步说明了异欧前胡素的药理效应依赖于膜蛋白α7nAChR的存在。复制小鼠内毒素血症模型，ELISA技术检测小鼠血清中相关细胞因子水平，发现异欧前胡素能降低促炎因子 IL-6、TNF-α的表达，并上调抑炎因子IL-10的表达，其效果和阳性药物尼古丁相当。而当通过甲基牛扁碱阻断α7nAChR后，异欧前胡素的抗炎效果显著下调，说明体内异欧前胡素抗炎效应和α7nAChR蛋白密切相关。通过对ATK/NF‐κB /P38 相关信号通路蛋白的检测发现，异偶前胡素能剂量依赖性的抑制 AKT 的磷酸化，降低NF‐κB的合成，减少P‐38的磷酸化，说明异欧前胡素结合α7nAChR蛋白后，可以激活后者对该信号通路的抑制作用。目前采用α7nAChR 基因敲除小鼠，复制醋酸致小鼠扭体实验模型和小鼠内毒素血症模型，考察异欧前胡素体内抗炎效应变化情况的实验工作由于疫情的影响正在进行中。上述结果表明α7nAChR为异欧前胡素药理作用的靶点蛋白。项目资助已发表SCI论文1篇。项目投入经费20万，支出16万，各项支出基本和预算相符，剩余经费4万，将继续用于本项目后续研究。

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