低共熔溶剂（DES）-酶蛋白构效关系及其影响酶促花色苷选择性酰化的机理研究

With the development of sustainable solvents for green chemistry, the potential applications of the deep eutectic solvents (DES) have become an important research hotspot in the field of the biocatalysis, while the structure-function relationships of biomacromolecule-DES still have not been clearly clarified. In this project, a series of DES from biomass materials with excellent characteristics including high solubility toward substrate, biodegradablity, atom economy and significant enhancement of the enzyme activity and stability will be rationally designed, synthesized and screened for their applicability in the enzymatic regioselective acylation of anthocyanins. The effects of the composition, structure and properties of the DES on the acylation rate, selectivity, product yied, and enzyme stability will be systematically characterized. Subsequently, the study of kinetic and thermodynamic parameters and the analysis of protein structure changes using the spectroscopy method (such as the infrared spectra, circular dichroism, fluorescence, and NMR spectra) and molecular docking technique will also be explored in order to better understand the molecular mechanism of the enzyme-mediated anthocyanin acylations in DES. At last, based on the above research work, the enzymatic reactions in DES systems with highly efficient and regioselective preparation of a diverse library of anthocyanin ester derivatives will be well established. Moreover, the factual information of the enzyme DES-protein interactions will not only instruct the green DES synthesis and enzyme molecule modificaton, but also enrich the theoretical principle of DES used in biocatalysis.

低共熔溶剂（DES）在生物催化领域中的应用是当前的研究热点，但其与生物大分子的相互作用关系却始终未阐明，成为其发展的瓶颈。本项目拟理性设计、合成一系列基于生物质原料、溶解能力强、绿色可降解、原子经济的，可显著提高酶活性和稳定性，适用于酶促花色苷高效、高选择性酰化的新型DES；对比研究DES组成、结构、性质对酶促反应的速度、选择性、产率及酶稳定性的影响规律；总结酶在不同DES中的热、动力学行为变化，并借助光谱学技术（红外、圆二色、荧光及核磁共振光谱）和分子对接技术解析DES中酶蛋白的高级结构变化，揭示DES影响酶催化特性的分子机理。本研究可为DES的理性设计提供科学指导，DES-酶蛋白构效关系信息也将成为新酶分子修饰和改造的依据，有助于进一步丰富DES用于生物催化的理论基础；在以上基础上，基于DES介质的绿色、高效酶促花色苷酰化体系的首次建立，将构建具有重要工业应用价值的花色苷酯类化合物库。

糖苷类化合物（如花色苷）是一类广泛存在于生物体内，具有多种生物活性和药理功能的次级代谢产物，在食品、药品及化妆品领域中有着重要的应用。. 低共熔溶剂（DES）是一类由氢键受体（如季铵盐、季磷盐等）和氢键供体（如羧酸、糖、酰胺或多元醇等）组成的共熔混合物，在生物催化领域显示出巨大的应用，但其与生物大分子的相互作用关系却始终未阐明。本研究设计、合成了一系列基于生物基原料，具有溶解花色苷能力强、绿色可降解、原子经济特点的DES，并对其含水量、密度、电导率和粘度等理化参数进行了表征。并以此为基础，成功建立了具有自主知识产权的，提取率显著高于传统溶剂的胆碱-DES的花色苷及其类似物（9种色素及8种糖苷类化合物）高效分离纯化体系。. 在上述研究基础上，采用酶工程、溶剂工程及底物工程的策略，以商品化的CAL-B和TLIM酶或其新型磁性纳米固定化形式（Fe3O4@PDA@TLL、Fe3O4@CNC@CAL-B、Fe3O4@Starch@TLL）为催化剂，以花色苷及其类似物的酰化反应为模型，探讨DES组成、结构和性质对酶促反应的速度、选择性、产率及酶稳定性的影响规律，总结酶在不同DES中的热、动力学行为变化特征，建立了具有自主知识产权的花色苷及其类似物高效酰化反应体系，构建了具有重要工业应用价值的花色苷及其类似物酯衍生物库。并以电泳纯酶蛋白为基础，借助圆二色光谱技术，分析了26种离子液体中酶蛋白二级结构的变化，发现α-螺旋和β-折叠含量分别呈现降低和增加的趋势，这表明酶蛋白结构出现了解折叠和伸展的现象，柔性增加。同时，研究还发现离子液体的阴阳离子均是影响蛋白结构变化的重要因素，这为揭示DES影响酶分子催化特性机理奠定了基础，成为新酶蛋白分子修饰和改造的依据，进一步深化了对非水相酶学基础理论问题的认识。. 本研究的成功开展不仅为DES的理性设计提供了科学指导，更有助于进一步丰富DES用于天然产物制备及非水相生物催化的理论基础，具有重要的科学意义和应用价值。

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