单细胞水平精子Y染色体结构异质性的研究

Allelic homologous recombination during meiosis might bring the heterogeneity into chromosomes of sperm. Chromatin heterogeneity of sperm is a risk in genetic diagnosis and assisted reproduction, and a key of chromosome evolution and recombination mechanism research. Several studies confirmed and evaluated the structure heterogeneity of autosomal, but didn't mention the Y chromosome. Previous researches suggested that the dynamic recombination of Y chromosome in meiosis might bring the structural heterogeneity in sperm. Y chromosome is full of repetitive sequence and palindrome structure without a complete sequencing, so that lots of the structure variation of Y was barely understood and the detective method of autosome doesn't suit for Y chromosome. There is still a death of Y chromosome description, which brings a uncertain risk in genetic diagnosis and assisted reproduction. So, it is an urgent issue that finding out a appropriate target in Y chromosome, designing a suitable method to confirm and evaluate the structure heterogeneity of Y in sperm. In this study, we intend to analysis the AZF structure heterogeneity among the sperm from same individual by Accucopy PCR based on MALBAC, then reappraise the contribution of traditional peripheral blood AZF detection to assisted reproduction.

精原细胞减数分裂过程中的同源重组可导致精子染色质产生不均一性，即异质性。精子染色质异质性是基因诊断和辅助生殖中的一个风险因素，亦是研究染色体重组和进化机制的一个关键点。已有研究证实并评估了精子常染色体的异质性，而目前对精子Y染色体异质性的研究仍属空白，这给Y染色体相关疾病的基因诊断和辅助生殖带来了不确定的风险。由于Y染色体结构特殊，使得研究精子常染色体异质性的测序法并不适用于Y染色体。在Y染色体上寻找合适的靶点，针对其结构特征设计适宜的检测方案来直接证实精子Y染色体是否存在异质性，是目前亟待解决的问题。本研究拟在两名核型分别为(46,XY)和(47,XYY)的男性中，以AZF区结构变异为靶点，通过MALBAC和Accucopy PCR分析同一男性精子之间的染色体结构异质性，并获得其重组模式和重组频率，提示Y染色体可能存在的进化机制，重新评估传统外周血AZF检测在辅助生殖中的提示作用。

精子发生是人类生殖中最重要也是最为复杂的生理过程之一，减数分裂过程中的染色体重组既是维持遗传多样性的重要机制，也是维持基因组稳定性的重要机制。精子作为男性的生殖细胞，是遗传信息从父代向子代遗传的关键节点。以往的研究已经证明染色体重组事件在精子常染色体中频繁发生，然而精子Y染色体在减数分裂中是否存在重组事件一直没有定论和明确的证据。通过Y染色体异质性的研究，比较不同精子之间的Y染色体结构，可以通过重组事件发生的热点及其模式倒推出这一区域曾经发生的结构变异，从而推测该区域的进化过程。本实验从云南地区一名男性志愿者处获得捐献的精液2.5毫升，通过去除精浆和其他非精子细胞之后，通过显微操作分离随机获得单个精子标本共255例。单细胞水平精子分别经MALBAC单细胞全基因组扩增获得线性放大的基因组DNA，经扩增产物浓度检测、PCR扩增等质控检测，通过基于SRY及G6PD基因的PCR扩增鉴定X染色体或Y染色体。通过基因组随机浅层高通量测序对精子的基因组结构进行检测，分析精子标本中是否存在结构差异。随后针对Y染色体上的高频重组区域AZFc的STS位点进行PCR扩增，检测是否有精子存在AZFc缺失的情况。实验结果显示，在受检的97例Y精子中，有2例精子存在染色体区域的结构变异；在受检的Y精子中，发现1例AZFc区缺失的精子。实验结果提示精子的Y染色体在减数分裂过程中存在染色体重组事件，进而提示亲代生殖细胞的遗传物质可能不完全均一，子代男性可能从其父亲处获得与父亲体细胞Y染色体不同的结构变异。

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