三水白虎汤抑制类风湿关节炎滑膜增生的作用靶点筛选

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81072936
项目类别：
面上项目
资助金额：
34.0万
负责人：
肖长虹
依托单位：
南方医科大学
学科分类：
H3302.中西医结合临床基础
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
马剑颖；杨敏；袁立霞；刁建新；李凯芹；左芳芳；
关键词：
多肽三水白虎汤噬菌体展示技术滑膜成纤维细胞

项目摘要

本项目采用多轮淘选方法，以类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞（RASFs）作为筛选靶细胞，从噬菌体环七肽库中筛选与三水白虎汤(SSBH)含药血清处理的RASFs的特征性结合短肽。再对该短肽进行测序，并经三肽残基分析、蛋白多序列对比、分泌蛋白预测和跨膜蛋白预测等座钟生物学信息分析，筛选到与RASFs增生相关的目标功能蛋白。对特征性短肽进行特异性和生物活性鉴定，然后用目标功能蛋白调取、分离RASFs的膜蛋白，以此作为SSBH抑制RA滑膜细胞增生的作用靶点。为三水白虎汤治疗RA的作用定位、新药开发和复方中药制剂的药物靶点研究提供新的依据和创新性研究方法和手段。

结项摘要

本项目以双向蛋白电泳和噬菌体展示技术筛选三水白虎汤（SSBH）抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RASFs）增殖的作用的蛋白靶点和短肽靶点。1.完成了类风湿关节炎、骨关节炎滑膜成纤维细胞（RASFs、OASFs）的分离培养和鉴定，建立3株稳定的细胞系。2.建立并标准化SSBH含药血清的制备方法。3.MTT法确定SSBH抑制RASFs、OASFs增殖的最佳浓度和时间，20%含药血清同时作用RASFs和OASFs两种细胞72h后，显示该方可显著抑制两种关节炎来源的滑膜成纤维细胞增殖。4.ELISA测定SSBH对RASFs和OASFs分泌细胞因子IL-6、IL-17的影响，提示SSBH能显著抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞分泌IL-17。5.通过双向蛋白电泳技术研究SSBH作用于RASFs和OASFs的蛋白质组学，分析SSBH抑制RASFs增殖的作用靶点，结果显示11个蛋白在RA滑膜成纤维细胞中表达明显变化，15个蛋白在OA滑膜成纤维细胞中表达明显差异，其中与RASFs增殖相关的蛋白主要有IL-1Ra、OS-9、sorcin、Centrosomal。6.利用噬菌体展示技术以SSBH处理过的RASFs为靶细胞，生理盐水（NS）处理的RASFs为吸附细胞，全细胞差减筛选法对噬菌体十二肽库进行3轮淘选，挑取单克隆、扩增纯化噬菌体，并初步鉴定噬菌体克隆的亲和力。7.对阳性克隆进行了测序和生物学分析，发现了特征性短肽SGVYKVAYDWQH经筛选后被高度富集，约为56%（18/32），并经ELISA初步鉴定其亲和性大于其他短肽。8. 采用生物信息学方法对特征性短肽进行生物学分析，发现其与Vaspin、MTMR14、DST protein、CAD protein等相关。本项目为三水白虎汤治疗RA的作用定位、新药开发和复方中药制剂的药物靶点研究提供新的依据和创新性研究方法和手段。