SLIT-ROBO RhoGTP激酶激活蛋白2（SrGAP2）对足细胞骨架蛋白调节作用及分子机制研究

The cytoskeleton injury is a main feature of podocyte lesion and chronic kidney disease (CKD). Our previous studies indicated that slit-robo Rho GTPases activating protein (srGAP2) was enriched in the podocyte, and co-expressed with several genes involved in the cytoskeleton regulation. Moreover, the expression level of srGAP2 mRNA in the glomeruli was significantly decreased and negatively associated with proteinuria in the podocytopathy. In addition, using small interfering RNA (siRNA) against srGAP2, we confirmed initially that Rho-GAP domain of srGAP2 involved in multiple signaling pathways, such as Cdc42, RhoA and Rac1. Based on above evidences, we speculate that srGAP2 may play a role to maintain the function of podocyte by the regulation of Cdc42, RhoA and Rac1. Inhibiting the expression of srGAP2 could lead to the podocyte lesion and proteinuria in kidney diseases. However, there is few study reported the effect of srGAP2 on regulation podocyte cytoskeleton. To confirm this hypothesis, we will employ in vivo and vitro experiments to investigate the effects of srGAP2 on the podocyte injury and proteinuria initiation, and its potential mechanisms. The results of this study is expected to demonstrate the potential molecular mechanisms of srGAP2 associated with the cytoskeleton regulation of podocyte, and reveal the new target for the treatment of podocyte lesion and proteinuria in renal diseases.

细胞骨架异常是足细胞损伤，蛋白尿形成的关键环节。本课题组前期研究发现，Slit-ROBO RhoGTP激酶激活蛋白2（srGAP2）主要在肾小球足细胞中表达，且与多种足细胞骨架蛋白编码基因存在共表达关系。足细胞疾病中srGAP2表达下降，且与蛋白尿负相关；体外抑制srGAP2表达，可降低Cdc42、RhoA和Rac1等小分子GTP激酶表达量，后者对细胞骨架具有调控作用。因此，我们推测srGAP2在维持足细胞骨架形态和正常功能中发挥重要作用，但仍需进一步研究证实。本课题拟在前期研究基础上，利用足细胞损伤模型，通过co-IP及尾静脉质粒注射等技术，明确srGAP2对细胞骨架调节蛋白Cdc42，RhoA和RAC1的调控方式，对维持足细胞骨架结构稳定和足细胞功能的作用；及在足细胞损伤和蛋白尿形成中的意义。旨在揭示新的足细胞骨架调控和损伤的分子机制，为发现新的肾脏疾病治疗靶点提供理论依据。

糖尿病肾病是最常见的导致慢性肾功能不全的病因，其足细胞损伤是导致糖尿病肾病蛋白尿和肾功能损伤的关键因素之一。足细胞作为终末分化细胞，在维持肾小球的滤过屏障的完整性中发挥了关键的作用。但是导致糖尿病肾病中足细胞的骨架损伤，以及蛋白尿形成和肾功能损伤的分子机制仍然不清楚。我们首次发现Slit-Robo GTP激活蛋白（slit-robo GTP activating protein 2,srGAP2)是足细胞骨架的一个关键的调控分子，并且在肾小球的滤过屏障功能的维持中发挥了关键的作用。通过分析糖尿病肾病 和正常对照的肾小球转录组学数据，我们发现SrGAP2和患者的蛋白尿和肾功能下降密切相关，且通过WGCNA分析，SrGAP2是一个关键基因（hub gene）。荧光双套染和WB结果证实了SrGAP2在肾脏中特异性的表达于足细胞上，同足细胞特异性的标志物Synaptopodin存在共定位。足细胞SrGAP2的mRNA和蛋白水平均在DN患者和db/db小鼠的肾小球中出现下降。体外培养的足细胞也证实，高糖或TGF-β可以诱导足细胞SrGAP2表达下降。功能和机制研究提示，srGAP2可以稳定足细胞的细胞骨架，抑制足细胞的迁移，并且是通过与RhoA/CDC42的相互作用实现的。我们进一步的利用斑马鱼模型观察了SrGAP2a敲除后的作用，研究显示敲除斑马鱼中的SrGAP2a可以导致斑马鱼的水肿，足细胞的足突融合。最后，我们还证实了过表达SrGAP2可以改善糖尿病肾病小鼠模型的足细胞损伤和蛋白尿。我们发现，利用尾静脉注射srGAP2的质粒，可以发挥保护db/db小鼠足细胞骨架损伤的作用，并且可以降低其蛋白尿水平。我们的课题研究，首次发现了srGAP2是一个调控糖尿病肾病足细胞损伤的关键分子，并且其是通过影响RhoA/CDC42的活性，发挥稳定足细胞骨架的作用。相关的研究结果为进一步的探索新的足细胞损伤分子干预靶点提供了理论基础。

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