ATF4/6介导的miR-145-HDAC4表观调控轴在多发性骨髓瘤细胞自噬性死亡中的作用研究

Multiple myeloma (MM) cell apoptosis can be induced by mitochondria or endoplasmic reticulum stress. Autophagy can prevent apoptosis, but excessive autophagy may reverse this function. Preliminary work showed that expression of miR-145 decreased in MM, while expression of HDAC4 increased and they was negative correlated with each other. We have evidenced that HDAC4 was a target of miR-145 by 3'UTR reporter gene system. Autophagy and apoptosis can both be induced by miR-145 overexpression. Those results suggested that miR-145-HDAC4 axis may play a role in the regulation of apoptosis and autophagy. The project aims to explore the role of and autophagy miR-145-HDAC4 axis in apoptosis and autophagy by adopting overexpression or interference, flow cytometry, confocal, Western Blot in vivo and in vitro. The stage of autophagy and its target were to be identified by use of autophagy inhibitors and autophagic flux monitoring. Furtherly, ChIP-seq analysis will be used to illustrate the downstream acetylation sites of ATF4 / 6 by HDAC4 and whether there is a feedback loop of miR-145- ATF4/ATF6. Those will clarify the epigenetic mechanisms of microRNA-HDAC axis in autophagic cell death, which will provide the basis for new diagnostic and discovery MM therapeutic targets.

多发性骨髓瘤（MM）细胞凋亡可由内质网应激或线粒体介导，自噬可防止细胞凋亡，但过度自噬则发生逆转。前期工作表明在MM中miR-145表达降低，HDAC4表达升高，两者负相关，3’UTR报告基因系统提示其为miR-145的靶基因，且当miR-145过表达时可诱导细胞凋亡及自噬，提示miR-145-HDAC4轴可能在细胞凋亡及自噬中发挥调控作用。本课题拟采用过表达和干扰、流式细胞学、激光共聚焦、Western Blot、动物成瘤等技术在体内外探讨miR-145-HDAC4轴在MM细胞凋亡和自噬的影响，并利用自噬抑制剂及自噬流监测工具，明确诱导自噬的阶段和靶点，ChIP-seq分析miR-145通过HDAC4影响下游ATF4/6的乙酰化位点以及是否会反馈调控miR-145的表达，从而系统探讨microRNA-HDAC轴调控细胞自噬性死亡的表观遗传机制，为发现MM新的诊断和治疗靶点提供依据。

多发性骨髓瘤是一种以恶性浆细胞聚集骨髓并在血液或尿液中出现单克隆蛋白为特征的恶性疾病，目前MM约占所有癌症类型的1%，全世界每年约有8万人死于该病。该病好发于老年人，随着我国人口老龄化，发病人数有增加的趋势，并且容易出现复发和耐药。该项目围绕多发性骨髓瘤临床一线药物耐药难题，从临床检验入手、利用芯片检测、生信分析等多种工具，获得了多发性骨髓中异常的MIRNA表达谱，结果发现MIR145-3p在多发性骨髓瘤中显著低表达，并且发现该分子与多发性骨髓瘤的临床分期预后等指标密切相关。在此基础上，该项目深入研究了该分子在多发性骨髓瘤细胞凋亡、自噬等生物学进程中的作用，发现MIR145-3p可以促进细胞发生自噬和凋亡。HDAC4及其家族分子是多发性骨髓瘤药物开发与临床治疗的重要靶点，结合生物信息学工具，结果发现MIR145-3p可以直接与HDAC4结合，并诱导MM细胞发生自噬和凋亡，促进乙酰化水平Acety-H3（lys9/14，lys18）升高。为进一步明确MIR145-3p及HDAC4的作用机制，该项目探讨了自噬关键信号通路-mTOR信号通路、凋亡信号通路-BLC2L11通路的变化情况，结果发现MIR145-3p-HDAC4表观调控轴通过下调mTOR信号通路分子MTORC1表达、上调促凋亡分子BCL2L11表达来促进细胞发生自噬性死亡，此外，MIR145-3p-HDAC4表观调控轴还可以促进内质网应激分子ATF4的表达水平升高。硼替佐米（Bort）作为治疗MM的一线药物，常与其他药物联合应用提高治疗效果，该项目为探讨MIR145-3p/HDAC4与Bort的抗MM作用，分别将MIR145-3p和si-HDAC4与Bort联合应用，结果表明，相对单一作用组，MIR145-3p或si-HDAC4与Bort联合应用时显著诱导细胞凋亡和自噬。进一步构建MM动物模型，观察MIR145-3p结合Bort对MM的治疗效果，结果发现MIR145-3p可以显著降低瘤块体积和大小，并且当和Bort联合应用时，抗MM作用最明显，这些结果提示MIR145-3p通过诱导自噬性死亡来增强Bort的抗MM作用。该项目结果为多发性骨髓瘤的临床诊疗提供新的研究视野，研究成果发表于autophagy杂志（IF=11.059），并申请获得国家发明专利3项，展示出良好的临床应用前景。

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