INT复合物调节U snRNA 3'加工的结构基础

U-rich small nuclear RNAs (U snRNAs) are key catalytic components of spliceosome during splicing of precursor messager RNA (pre-mRNA). The transcriptional termination and maturation of the snRNAs relies on its 3'-end processing, which is mediated by the integrator (INT) complex. As a protein complex composed of at least 14 subunits, INT has a molecular weight of over than 1 MDa. Despite its role in mediating small nuclear RNA maturation, disrupted/mutated INT has been recently identified closely associated with embryogenesis difficulties, neuro disorders, and even cancer. Nevertheless, little is known about INT complex’s mechanisms of assembling and functioning. Therefore, this project is designed to investigate the functions of integrator complex from a structure study-based view...In order to obtain homogenous and well-qualified multi-complex or sub-complex structural information of INT, we plan to comprehensively integrate multiple extraction methods for purification of tag-based merged proteins, then applying cryonic electron microscopy and X-ray crystallography analysis for capture of images and construction of molecular models. We also plan to explore INT complex’s molecular functions as well as the impact of components mutation on INT complex, so as to explain the regulation of INT-mediated U snRNA transcription on a sub-atomic scale.

U snRNA是剪接体对前体信使RNA进行剪接的核心催化组分，其转录的3‘加工成熟依赖于整合因子(INT)复合物。INT复合物是一个至少由14个亚基组成、分子量超过1MDa的蛋白质复合物，近期研究展示出INT复合物及组分在个体发育中的重要作用，其组分突变能够引起发育障碍、神经系统疾病乃至肿瘤生成，但是基于该复合物空间结构的组装机制和功能执行等问题仍处于未知状态。据此，本项目计划对INT复合物进行结构解析和机制研究。计划通过标签蛋白质组分过表达和内源性提取的方法，综合多种纯化分离技术手段，获取性质均一且良好的完整INT复合物或组分蛋白，随后借助冷冻电镜和X射线晶体学技术进一步捕获其结构，搭建原子模型。在结构分析的基础上，本项目还希望明确各组分在INT复合物组装时发挥的作用和关键突变对复合物功能的影响，最终在分子水平阐述INT复合物调控U snRNA 3’加工和转录终止的作用机制。

整合因子复合物（Integrator complex，INT复合物）是近年来被广泛研究的一个细胞核内大分子复合物，其主要作用是对U snRNA转录形成的初级转录本的3’末端进行切割和加工，从而得到成熟的转录本。此外，INT复合物还参与了蛋白质编码基因的转录过程中的暂停-释放，在RNA聚合酶II的功能执行中起到了非常重要的作用。.本项目主要开展整合因子复合物开展结构引导的机制研究。整合因子复合物包含了至少14个亚基INTS1-INTS14，总的分子量超过了1M道尔顿。因此在研究过程中，我们联合采取了不同的表达与纯化方法，包括原核表达系统E.coli、昆虫细胞表达系统sf9、哺乳动物表达系统293F以及CRISPR-Cas9介导的位点特异性敲入细胞系，以期获取性质均一、质量充足的蛋白质样品。研究的目的捕获其冷冻电镜结构并搭建其原子模型；同时辅助X射线晶体学技术，阐述INT复合物的作用机制。.围绕上述研究目标，本项目已成功开展了不同体系的外源性重组表达纯化测试，我们发现在E.coli/ sf9等低等动物的表达体系中，复合物蛋白均不能够得到有效的折叠，导致蛋白聚集。在293F细胞的重组过表达中，单一蛋白的表达仍然不能实现均一性的纯化，当多组分同时转染时，复合物可以表达但性质欠佳。采用慢病毒侵染和CRISPR-Cas9基因编辑技术，我们构建了组分INTS4融合flag-strep标签的293T/Hela S3细胞系，并且通过核质分离和亲和纯化方法对组装了标签的复合物进行了纯化。质谱鉴定与电镜检查均确认了靶标蛋白的存在。然而由于竞争对手的率先发表（Sabath et al, Nat Commun, 2020; Zheng et al, Science, 2020），与课题组的相关研究完全重合，故该项目未继续进行。我们对相关研究背景进行了总结，并以封面形式发一篇中文综述（中国生物化学与分子生物学报, 2021）。同时，课题组发挥所在单位优势，积极开展了诸多其他方面的研究，共发表了3篇SCI收录文章（Cell cycle, 2020；Biomedical Chromatography, 2021；Journal of Translational Medicine, 2021），并全部标注了本项目的基金号。

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