七厘散促毛囊干细胞组织工程皮肤修复创面及细胞分化的研究

组织工程皮肤在大面积皮肤缺损病人的早期救治中发挥重要作用，但皮肤创面血管化进程慢、局部营养不良、创面感染等导致组织工程皮肤移植成功率低，严重限制了其进一步应用。研究证明中医中药通过抗菌消炎、促进创面血管化、促进细胞增殖和分泌，修复皮肤创面，中医中药可通过上述作用提高组织工程皮肤移植成功率。毛囊干细胞（FSC）能分化为表皮及毛囊，以其为种子细胞有望解决组织工程皮肤缺乏毛囊的缺陷。前期研究显示七厘散能促进小鼠触须部创面和毛囊修复，其含药血清能促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖。本项目拟分离人头皮FSC与成纤维细胞，气-液界面3-D培养，构建组织工程皮肤，利用七厘散含药血清促进人FSC组织工程皮肤分化出毛囊；并将七厘散作用于人FSC组织工程皮肤移植前后的裸鼠全层皮肤缺损创面，通过抗菌消炎，促进创面血管化，促进表皮及毛囊形成，提高移植成功率，为解决或改善目前组织工程皮肤研究中存在的缺陷提供重要的实验依据。

目前构建的组织工程皮肤种子细胞多为角质形成细胞，其为终末分化细胞，不能分化出皮肤附属器，移植后血管化进程慢也是影响组织工程皮肤应用的一个关键问题。毛囊干细胞（FSC）能分化为毛囊、皮脂腺等皮肤附属器，创伤时还能修复表皮，这些特性使其成为组织工程皮肤理想的种子细胞，但FSC增殖能力差，限制了其进一步应用。七厘散通过活血化瘀、生肌等作用，能促进皮肤创伤的愈合。本项目旨在探讨七厘散能否促进组织工程皮肤血管化、促进FSC组织工程皮肤修复皮肤缺损、促进FSC分化出皮肤附属器等问题。主要结果如下：①FSC的分离、培养、鉴定：实验中对FSC的获取方法进行了改进，本研究采用机械法结合Ⅰ型胶原酶-胰蛋白酶两步酶法，并以Ⅰ型胶原预铺培养板、以体积分数1%胎牛血清的K-SFM培养基短时间培养，发现Ⅰ型胶原和低浓度血清能促进上皮样贴壁。② 七厘散含药血清对FSC和毛囊成纤维细胞增殖的影响：遵循含药血清的制备原则，制备七厘散含药血清，结果发现体积百分比2.5%的七厘散含药血清对FSC增殖作用最佳，体积百分比5%的含药血清对毛囊成纤维细胞增殖作用最佳。③ 经筛选，选用皮耐克（主要成分为无末端胶原蛋白）为本研究的组织工程皮肤支架。④ Transwell双层培养板、气-液界面构建FSC+毛囊成纤维细胞+皮耐克支架的组织工程皮肤，体外连续培养达到14d。⑤ FSC组织工程皮肤对裸鼠皮肤创面的修复研究发现：七厘散预处理裸鼠皮肤创面，在早期能改善创面微环境，减轻炎症反应，使得创面微环境更有利于修复。在实验过程中发现，无论大体观察还是显微观察，七厘散外用及七厘散外用+内服组对皮肤创面的修复优于其他组，提示外用是七厘散的最佳用药方式，构建时BrdU标记的FSC在组织工程皮肤移植后14d仍可检出，并且仍有保持干细胞的特性，证明移植的FSC能分化为表皮，直接参与了表皮的修复，七厘散能促进创面处的再上皮化，并促进愈合区域表皮及真皮的修复和改建，使其更趋于正常皮肤。进一步研究发现七厘散中所含的活性成分龙血素A能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进FSC增殖和分化，提示中药外用有可能和创面局部的细胞和分子相互作用，相互调节，激活多种途径，保持FSC良好的功能状态，促进创面修复，进一步研究七厘散中活性成分对FSC增殖和分化相关通路的调节机制将是我们今后的研究方向。

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