利用高通量测序技术检测在不同基因表达水平和不同环境中蛋白编码基因的点突变对适应度的影响

The rate of protein sequence evolution has been studied for half a century and is critical to the reconstruction of evolutionary history and mechanisms. Following the increased availability of genomic data, the functional importance of a protein, widely thought to approximate the level of functional constraint, has only a minor role on the protein evolutionary rate, whereas protein expression level is found to be a major determinant. Subsequent studies by us and others identified multiple reasons behind the impact of expression level on the rate of protein sequence evolution. Because some of the above studies have been scrutinized by direct experimental tests, we plan to synthesize all single mutant sequences of specific proteins, and use High Throughput Sequencing to measure the genetic effects of these mutations on yeast growth rate under various expression levels of the mutated gene and different environments. This study will (1) give rise to a comprehensive single mutant fitness landscape of protein coding genes; (2) facilitate prospective prediction of protein sequence evolution through single point mutations; (3) reveal the dependency of fitness landscape on the expression level and functional importance of the mutated gene; (4) detect the validity and applicability of the mechanical hypotheses for the determinant of protein sequence evolutionary rate. Results of this research will improve our understandings of the molecular mechanisms governing protein sequence evolution, and establish novel strategies and in studies of protein evolution, which should be widely applicable in related researches such as the prevalence and drug-resistance of evolving pathogens.

已经被研究了超过半个世纪的蛋白质序列进化速率，是重构进化历史和构建演化机制的一个关键因素。随着基因组数据的增加，包括我们前期工作的研究发现，基因的表达水平，比一直被广泛认为最能限制蛋白质序列进化速率的蛋白质功能重要性，起着更重要的决定性作用，并提出了基因表达水平影响蛋白质序列进化速率的多种假说。由于部分假说一直缺乏直接实验证据的支持，本研究计划通过高通量测序技术，对多个蛋白质编码基因在不同的表达水平以及不同的培养环境下，检测涉及所有可能点突变的影响酵母生长速率的遗传效应。该研究将全面测定特定蛋白编码基因的点突变适应度景观；提供蛋白编码基因进化模式的前瞻性预测；鉴定基因表达量和基因功能重要性对适应度景观的影响；检验决定蛋白质进化速率的各种分子机制模型的正确性和适用范围。该研究结果将实现蛋白质序列进化模式的研究创新，并为研究病原生物的流行性与耐药性的演化过程提供新的技术与理论基础。

在进化生物学和遗传学领域具有广泛兴趣的一个重要目标是基因型到表型映射 (GPM)。对于生物体适应性的表型，GPM 通常以适应性景观的形式表示，其中记录了野生型基因突变的表型后果。人们普遍认为，基因的适应性景观受基因表达水平等因素的影响，但这个影响既没有被量化也没有从机制上根本解决。在当前的这项研究中，我们设计了一种新的实验测定法，能够测量由蛋白质编码基因的所有单核苷酸突变组成的适应性景观。我们使用该测定来确定一个外源基因（GFP）和一个条件必需基因（URA3）的适应性景观，每个基因由活性相差 10 倍的两个启动子驱动。在不同培养基中测量的适应性景观揭示了表达水平对其主要影响的三个独立证据线，包括（i）在不同表达水平的同一基因中发生的相同突变具有显着不同的适应性效应，（ii）与低表达时相比，当必需基因高表达时，对突变触发的功能变性具有更强的耐受性，（iii）由于各种随机分子错误，基因表达升高会增加突变触发的细胞毒性。因此，我们的发现为表达水平对基因适应性景观的影响提供了明确的证据和新颖的机制。

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