柳树SPR基因家族调控微管延伸方向分子机理的研究

The molecular mechanism of tubulin and microtubule associate protein (MAPs) regulate the morphology of cell, tissue and organ in plants has become a research focus. SPR is a plant specific MAPs, the molecular mechanism of SPR regulate microtubule elongation in woody plants still unknown. This project treat willow as research object, firstly cloning the willow SPR genes, and use the method of real-time PCR and histochemical GUS staining by using Promoter:GUS transgenetic plant to investigate the different expression level of SPR genes in different tissues; Secondly, the Genes:GFP transgenetic plant will be used to locate the SPR in plant cells; Lastly, the physiological and biochemical features (cell size, cell extend direction, microfibril angle and mechanical strenth) and the microtubule structure of up and down regulation transgenetic plant will be measured expect to find out the SPR function relate to microtubule elongation. The goal of this project is to analysis SPR genes regulate the microtubule elongation in woody plants and provide theory basis for the forestry improvement.

微管结合蛋白（MAPs）调控植物细胞、组织、器官形态的分子机理是近年来研究的热点。SPR为植物特有的微管结合蛋白，其调控木本植物微管延伸方向的分子机理现在还不得而知。本项目以柳树为研究对象，首先对柳树SPR基因家族成员进行克隆，并通过启动子连接GUS转基因和荧光定量PCR的方法对SPR基因在不同组织的表达量进行研究；其次，将SPR连接GFP转基因对SPR在细胞的定位进行研究；最后通过正义、反义、RNAi技术转基因，比较分析转基因植株和野生型植株之间的生理生化参数差异（细胞大小、细胞延伸方向、纤维素微纤丝角、机械强度等）以及微管结构变化，推断出SPR基因在柳树微管延伸方向中的作用。以期解析SPR基因调控柳树微管延伸方向的分子机理，为林木遗传改良提供一定的理论基础。

以柳树为研究材料，共鉴定出8个有功能的α-微管蛋白和20个β-微管蛋白基因。在所有的动物和绝大多数植物中，α-微管蛋白和β-微管蛋白的数量都是一致的，这也保证了微管蛋白1:1二聚体形成。而本研究所鉴定的α-微管蛋白的数量远远少于β-微管蛋白（相差12个），这就难以解释柳树中的微管是如何聚合并最终行使功能的。通过研究发现，α-微管蛋白成员数量上的不足由其高表达量得以补充，并维持微管蛋白1:1的平衡。也就是说这8个α-微管蛋白基因形成α-微管蛋白的数量与20个β-微管蛋白基因形成的β-微管蛋白数量一致（差别主要是α-微管蛋白的种类少了）。研究还发现，α-微管蛋白家族成员氨基酸C末端存在异于其他大多数物种的特殊氨基酸，而根据以往的研究结果，这些“异常”的氨基酸将阻碍微管蛋白的翻译后修饰和之后的聚合。所以研究推测，柳树中存在新的翻译后修饰机制，根据这些“异常”氨基酸的种类，将其命名为：deleucylation，demethiolation，deglutamynation和deaspartylation。.柳树中克隆鉴定了6个SPR1家族成员，我们将其命名为SmSPR1，SmSPR1L1-SmSPR1L5，聚类分析显示这些成员可以分为三个Class；氨基酸序列分析显示，SPR1家族成员的N’端和C’端保守，且存在3个保守结构域；荧光定量PCR的结果显示，SPR1家组成员在各个组织中具有表达，且SmSPR1为主效基因；启动子连接GUS转基因烟草分析显示，SPR1存在组织表达差异，在分生组织中表达最为明显；SRP1连接GFP转基因原生质体分析显示，SPR1在细胞中主要定位于细胞核、细胞膜、细胞质，而不定位于叶绿体；过表达SPR1转基因拟南芥造成了暗培养下下胚轴的螺旋生长，而光下，转基因植株与野生型植株无差异。通过Pull-Down、酵母双杂、双分子荧光互补实验，我们发现SPR1能与光形态调控基因COP9和HY5结合，这为过表达转基因SPR1仅在暗下而非光下出现螺旋表型提供解释。

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