免疫受体NKG2D及配体二维反应特性及微机械力调控的分子机制的研究

NKG2D is one of the most important activating immune receptor expressed on imunne cells. It regulates immune system's innate and adaptive immune responses to kill tumor or viral infected cells. It is well known that an immune cell works in a very complicated biomechanical microenvironments. However,it is still not clear that how does mechanical force regulate NKG2D binding to its ligands on two-dimensional (2D) cell membrane and how does mechanical force dynamically regulate these bindings and NKG2D and ligands' molecular conformations. We propose to use single-molecule biomechanical assay and molecular dynamic simulation to study the 2D molecular bindings of NKG2D to its ligands at a single-molecule level. This proposal includes: 1) in-situ measurements of the 2D binding kinetics of recombinant or natively expressed NKG2D interacting with their ligands using biomembrane force probe (BFP); 2) characterization of how cell membrane's micro-environments regulates NKG2D/ligands interactions; 3) characterization of how mechanical force regualtes NKG2D's bindings with different ligands; 4)investigation of the mechanical regulation of NKG2D's and its ligands' conformations.This study will greatly improve our understanding on the molecular mechanism of how NKG2D activates CD8 T cell and/or NK cell's immune responses and will provide new important insights for anti-cancer and anti-virus drug design and important experimental fundamentals for anti-cancer immunotherapies.

NKG2D是免疫细胞表面一种重要激活受体，调控着免疫细胞在癌症或病毒感染过程中的固有性和适应性免疫应答。而免疫细胞工作在复杂的生物力学微环境中，目前尚不清楚：机械力如何调控NKG2D与配体在免疫细胞表面的二维分子反应、分子结构和相应的免疫活化功能。申请人利用生物膜力学探针平台及相关先进的单分子检测技术，结合分子动力学仿真等多种方法，在单分子水平上深入研究NKG2D和其配体的反应与分子结构、功能间的关系 。主要包括：1）系统研究纯化型和内源型NKG2D及其配体反应的二维反应动力学反应; 2) 深入了解细胞膜微环境对 NKG2D及其配体反应的调控作用；3)深入研究机械力对NKG2D及其配体反应的动态调控作用及分子结构上的调控机制。本研究将进一步揭示NKG2D激活免疫应答的分子机理，可为研发NKG2D相关的抗肿瘤、抗病毒的新免疫分子药物及开拓免疫疗法的新思路提供实验基础和理论依据。

NKG2D是NK和T细胞表面非常重要的激活型受体之一，它有许多MHC的同源蛋白配体，这些配体在正常细胞表面很少表达或不表达，但在肿瘤或感染的细胞表面表达量升高，是天然的肿瘤抗原。越来越多的研究表明，MHC与TCR的相互作用受到力的调控，NKG2D的配体作为MHC的同源蛋白，其与受体的相互作用是否受力调控还不清楚，同时NKG2D对配体的识别机制及其与肿瘤的关系还不明确。针对这些问题，我们使用基于细胞原位的二维(2D)动力学检测方法，单分子力谱技术(Biomembrane force probe，BFP)，分子动力学模拟(MD)，免疫学实验等方法检测正常人和肝癌病人NK细胞表面NKG2D与配体互作的动力学参数，研究NKG2D对配体识别的力学-化学耦合机制及其与肿瘤的关系，并通过体外功能实验进行验证。我们发现不同配体与NKG2D二维原位互作的动力学参数比基于三维(3D)溶液态BIACore的测量值有更广的范围，并且这些2D动力学参数与配体刺激NK细胞分泌IFN-γ的效力呈正相关。此外，NKG2D和配体的解离对机械力敏感，尤其是MICA，它与NKG2D的解离有非常明显的“逆锁键”现象，且在10pN附近键合时间达到峰值1秒左右。MD结果也表明在力的作用下，MICA与NKG2D解离时结构发生改变并与受体形成新的氢键；这一观察结果启发我们进行抗原识别过程中TCR-pMHC相互作用的力学-化学耦联机制的研究，目前TCR的工作已经被Molecular Cell杂志接收。通过体外实验我们发现，MICA激活NK细胞这一过程也受到机械力的调控。病理情况下，肝癌的发生常伴有肝硬化，组织微环境变硬可能调节肝脏居留NK细胞的功能。我们发现肝癌病人远端癌旁NK细胞表面的NKG2D与MICA的键合时间短于其它部位的。总的来说，我们的结果表明：微机械力对NKG2D和不同配体的结合具有不同程度的调控作用；力能显著增强NKG2D与MICA的结合和结合后对NK细胞的激活；组织微环境可能会重塑NKG2D对机械-化学刺激的反应。我们的发现不仅揭示了NKG2D和配体原位反应的特性，而且阐明了NKG2D介导NK细胞产生免疫应答的力-化学耦连机制，为NKG2D相关的抗肿瘤和抗病毒的药物研发提供了新的思路，为抗肿瘤免疫疗法提供了新的实验和理论基础。

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