基于时间分辨荧光免疫层析的sST2和NT-proBNP双联快速定量检测方法的建立及其在心衰诊治和预后评估方面的应用研究

Heart failure is a common critical disease in clinical. NT-proBNP is the most common used biomarkers of heart failure, while ST2 is a newly discovered biomarker of heart failure in recent years, which can effectively evaluate the prognosis of heart failure. Current detection method center on ELISA, that is operation complicated and time consumed. This project set up a novel time-resolved fluorescence immunochromatography technology, which combines time-resolved fluorescence immunoassay and chromatography technology. It has the advantages of both technologies, rapid and sensitive, and effectively improve the work efficiency. Using lanthanide Eu3+ labled nanometer microspheres to mark sST2 antibody and the NT - proBNP antibody, respectively. sST2 antibodies and the NT – proBNP antibody is respectively packaged in the immune chromatography test paper. We can quantitatively detect the two biomarkers in a immune chromatography test paper at the same time in time-resolved fluorescence immunoassay with a small amount of serum. Then, we dynamic monitoring sST2 and NT - proBNP in serum of patients and animal model of heart failure, and compared with the results detected by the currently used methods in clinical. Also we research its application in the diagnosis and treatment and prognosis evaluation of heart failure. The technique provides a quick and easy quantitative detection method for clinical.

心衰是临床常见的危重病，NT-proBNP是目前临床最为常用的心衰标志物，sST2则是近年来新发现的心衰标志物，可以有效评估心衰预后。现有检测方法以ELISA为主，操作繁琐，复杂费时。本项目建立了一种新型的时间分辨荧光免疫层析技术，此技术结合时间分辨荧光技术和免疫层析技术，具备两种技术的优点，快速灵敏，有效提高工作效率。利用包裹镧系元素Eu3+的纳米微球作为载体分别标记sST2抗体和NT-proBNP抗体，在免疫层析试纸条的两条检测带上分别包被sST2抗体和NT-proBNP抗体，滴加少量的血清，就可以在一个免疫层析试纸条上同时进行两种心衰标志物sST2和NT-proBNP的时间分辨荧光免疫定量检测。随后动态监测心衰动物模型及临床患者血清中的sST2和NT-proBNP,并与目前临床上使用的方法比对，研究其在心衰诊治和预后评估方面的应用。该技术为临床提供一种快速简便定量的新型检测技术。

背景：血浆可溶性生长刺激基因蛋白2（sST2）是新一代心衰生物标志物，是心衰不良结局的独立预测因子。因此，迫切需要建立一种快速、灵敏的sST2检测方法。时间分辨荧光免疫层析分析技术结合了时间分辨荧光免疫分析技术与免疫层析技术，既具有时间分辨荧光免疫分析技术的灵敏度高、线性范围宽、稳定性好等特点，又具备免疫层析测定技术方便快捷的特点。.主要研究内容：基于时间分辨荧光免疫层析的sST2快速定量检测方法的建立；对该方法进行方法学的研究；心衰动物模型的建立和血清学动态监测。.重要结果和关键数据及其科学意义：经过条件摸索，最佳反应时间为15分钟;最佳上样量为80ul;该方案的检测灵敏度为2.14ng/ml;检测方案的标准曲线为y=0.0113x+0.0033, 线性范围是5-200ng/ml;该方案检测sST2时，与BNP,NT-proBNP,Galectin-3无交叉反应，特异性良好；准确度良好，相对偏差在15%以内；检测重复性好，批内差异<10%；批间差异<15%；稳定性试验结果显示，各个时间节点检测结果的相对偏差均<15%，说明检测产品稳定性良好。.动物实验方面：HE染色，对照组WKY大鼠从前期（12周到74周）心肌细胞形态正常，心肌纤维排列紧密，到后期（84周-108周）心肌细胞排列稍微紊乱；实验组SHR大鼠则随着周龄增长，心肌细胞形态从正常到肥大、炎细胞浸润、水肿、出血，心肌细胞排列从紧密到紊乱、部分纤维呈波纹状、间质水肿增宽、断裂。心肌组织TUNEL染色中，WKY大鼠随周龄增加（12周到66周），心肌组织凋亡率无明显变化，74周-108周，心肌组织凋亡率有所增加； SHR大鼠随着周龄增长，心肌组织凋亡阳性率持续增加。血压监测：与对照组WKY大鼠相比，SHR大鼠随着周龄增长，舒张压和收缩压均升高。血清学检测：随着周龄增加，两组大鼠血液中的sST2水平均逐渐升高，但SHR大鼠血液中的sST2水平始终高于WKY大鼠。动物实验表明，随着血压增高，SHR大鼠心肌细胞形态学发生改变，细胞排列方式发生改变，心肌细胞发生凋亡，逐渐发生心衰，血液中的sST2水平则随着心肌组织凋亡的发生而逐渐增高。表明sST2可以作为SHR大鼠心衰发生的标记物用于检测。

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