抗黄曲霉毒素 B1 鼠源单域抗体定向驼源化改造及其结合活性机制研究

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基本信息

  • 批准号：
    31601539
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    21.0万
  • 负责人：
    王佳
  • 依托单位：
    华中农业大学
  • 学科分类：
    C2008.食品质量与安全检测
  • 结题年份：
    2019
  • 批准年份：
    2016
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2017-01-01 至2019-12-31

项目摘要

The variable domain of heavy chain antibody from the family of Camelidae (Nanobody or VHH), as a entire binding antigen fragment, is a promising reagent in the development of immunoassays. However, due to the preference of immunized animals and antigens, there is no guarantee of obaining the antibody with high affinity. In this work we plan to isolate an antibody binding with Aflatoxin B1 (AFB1) on the basis of its sequence without immunization. According to the identities between mouse-derived single domain antibody (VH) and VHH，VH is mutant in site-directed on FR2 and randomized in CDR to construct a synthetic library. Based on computational design, site-directed mutations are carried out to get high affinity camelized VH with AFB1. The camelized VH (cVH) binding activity with AFB1 and its binding site are estimated based on the charateristics and structure changes. This study may provide a potentially useful approach to produce antibody against small molecules, and may make it possible for engineering recombined proteins defined by their sequences.
驼科纳米抗体 (VHH) 是一类保留了完整抗原结合活性的单域抗体，是免疫方法测定小分子类物质的重要工具之一。但是，受到免疫动物和试剂等因素的影响，高亲和性VHH存在制备难度大、成本高等缺陷。本研究以黄曲霉毒素B1 (AFB1) 为例，旨在不依赖动物免疫、对抗体基因序列驼源化改造以表达出抗AFB1高亲和力抗体。以抗AFB1鼠源单域抗体 (VH) 为模板，借助其与VHH的同源性，通过FR2结构域定点突变和CDR结构域随机化建立库容大而丰富的抗体合成文库；结合计算机模拟对特定位点突变，实现鼠源VH的定向驼源化改造，获得抗AFB1的高亲和力驼源化抗体 (cVH)。评价cVH与AFB1的结合活性，分析其结合位点及关键氨基酸的变化，揭示其结合活性机制。本研究可为获得精确识别AFB1类小分子物质高亲和力抗体提供夯实的理论基础，也可为基于抗体序列制备特定功能抗体提供有效的技术支撑。

结项摘要

黄曲霉毒素B1主要是由黄曲霉、寄生曲霉产生的次级代谢产物。驼源单域重链抗体VHH是一类分子量小、易于操作的抗原结合单位。但是，其制备成本相对较高，直接影响其应用。本项目以黄曲霉毒素B1为研究对象，借助驼源VHH与鼠源单域重链抗体VH的同源性，通过体外定向改造VH,实现鼠源VH的定向驼源化。本项目以小分子黄曲霉毒素B1为研究对象，在比对数据库中鼠源VH和驼源VHH的序列的基础上，定点突变了鼠源VH框架区FR2的V37F、R44E、L45R、W47G以及FR4上的W103R，并采用抗黄曲霉毒素B1驼源VHH的CDR3高变区。结果表明FR结构域上的特异性位点显著影响了驼源化VH的可溶性表达，通过优化采用酵母表达系统得到胞内上清表达的抗体，通过活性鉴定，得到其与AFB1的结合能力较鼠源VH显著提高;同时，通过从天然驼源VHH文库中筛选与AFB1特异性结合的VHH2,通过定点突变，CDR3置换以及CDR3随机化等处理，结合同源建模和分子对接等手段，表明CDR3高变区与AFB1之间氢键作用力会显著影响两者的结合能力，且位于CDR3高变区的125-136位氨基酸所形成的loop结构可以特异性结合AFB1,提高其与AFB1的亲和力。本项目的研究结果为小分子物质特异性鼠源VH定向驼源化提供研究基础，也为单域重链抗体的体外亲和力成熟提供理论支撑。

项目成果

期刊论文数量（4）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（1）
抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2017
  • 期刊：
    南方农业学报
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    马兰;刘爱平;王佳;王小红
  • 通讯作者：
    王小红
VHH Antibodies: Reagents for Mycotoxin Detection in Food Products.
VHH 抗体：食品中霉菌毒素检测试剂
  • DOI：
    10.3390/s18020485
  • 发表时间：
    2018-02-06
  • 期刊：
    Sensors (Basel, Switzerland)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Wang J;Mukhtar H;Ma L;Pang Q;Wang X
  • 通讯作者：
    Wang X
Cyclic peptide: a safe and effective alternative to synthetic aflatoxin B-1-competitive antigens
环肽：合成黄曲霉毒素 B-1 竞争性抗原的安全有效替代品
  • DOI：
    10.1007/s00216-019-01862-7
  • 发表时间：
    2019
  • 期刊：
    Analytical and Bioanalytical Chemistry
  • 影响因子：
    4.3
  • 作者：
    Mukhtar Hina;Ma Lan;Pang Qian;Zhou Youxiang;Wang Xiaohong;Xu Ting;Hammock Bruce D;Wang Jia
  • 通讯作者：
    Wang Jia
基于噬菌体展示技术抗黄曲霉毒素B1单链抗体的筛选及其蛋白结构分析
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2018
  • 期刊：
    中国生物工程杂志
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    庞倩;陈晶;王小红;王佳
  • 通讯作者：
    王佳

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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    李强

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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