汉滩病毒新型疫苗--免疫增强型VLPs疫苗的构建、免疫学特性和免疫保护作用的研究

Hantaan virus is the causative agent of hemorrhagic fever with renal syndrome with high mortality in China, but with no specific antiviral therapeutics. The control and prevention of HTNV infection is relied on vaccination. However, the effect of immune response induced by the currently applied vaccines is not good enough. Thus, there is an urgent need for developing an effective and safe vaccine. As a new form of vaccine candidate, virus-like particles (VLPs) has been reported to be potent vaccines for a variety of pathogenic viruses. Although VLPs are a promising candidate vaccines, it is highly desirable to develop approaches to enhance the immunogenicity of VLPs such that both efficacious humoral and cellular immune responses can be in induced. To develop a more effective hantaan virus vaccine, we design a chimeric HTNV VLP vaccine by incorporating GM-CSF or CD40L, which have been extensively used as effective genetic and protein adjuvants to enhance immunogenicity of antigens, into VLP as a molecular adjuvant. In this project, we express a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored form GM-CSF and CD40L for production of chimeric HTNV VLPs.We then investigate their immunological characteristics, their ability of protection against hantaan virus in mouse model, the mechanism of immune response and their safety, laying the groundwork for the development of HTNV vaccine.

汉滩病毒（HTNV）在我国主要引起肾综合征出血热（HFRS），该病危害极为严重，且缺乏特效的治疗药物，目前主要使用疫苗进行预防。使用最多的是灭活疫苗，虽有一定的免疫保护作用，但尚存在刺激机体产生免疫应答能力弱等不足。因此，急需研制免疫效果好、安全有效的HTNV新型疫苗。病毒样颗粒（VLPs）疫苗是一种新的候选疫苗，已被广泛用于新型疫苗的研制，但其免疫原性尚待进一步提高。本课题组前期已在哺乳动物细胞中成功包装出HTNV VLPs，在此基础上本项目拟将免疫刺激分子GM-CSF和CD40L与HTNV 结构蛋白融合，包装出HTNV嵌合VLPs，以期提高其免疫原性。将构建的嵌合VLPs疫苗免疫小鼠，通过系列体、内外实验对其免疫学特性和动物保护作用进行系统研究，评价其免疫应答能力和免疫保护效果；同时对HTNV嵌合VLPs的免疫机制和安全性进行初步探讨，从而为HTNV新型疫苗的研制奠定基础。

汉滩病毒（HTNV）在我国主要引起肾综合征出血热（HFRS），该病危害极为严重，且缺乏特效的治疗药物，目前主要使用疫苗进行预防。使用最多的是灭活疫苗，虽有一定的免疫保护作用，但尚存在刺激机体产生免疫应答能力弱等不足。因此，急需研制免疫效果好、安全有效 的HTNV新型疫苗。病毒样颗粒（VLPs）疫苗是一种新的候选疫苗，已被广泛用于新型疫苗的研制，但其免疫原性尚待进一步提高。本课题组构建获得了嵌合有免疫刺激因子CD40L或GM-CSF的HTNV VLP，并对所构建的嵌合VLP蛋白组成和结构进行了鉴定，结果显示CD40L或GM-CSF能与HTNV 结构蛋白GP、NP在真核细胞中正确表达并组装成HTNV嵌合 VLPs，蛋白成分正确，在透射电子显微镜下可观察到大小及形态正确的病毒样颗粒；检测了各HTNV嵌合 VLP刺激C57BL/6小鼠体液免疫的效果，结果显示HTNV 嵌合VLP即CD40L-VLP和GM-CSF-VLP较HTNV 灭活病毒疫苗及生理盐水对照组能刺激机体产生更高水平的特异性抗体及中和抗体；检测了各HTNV嵌合 VLP刺激C57BL/6小鼠细胞免疫的效果，结果显示CD40L-VLP和GM-CSF-VLP较灭活病毒疫苗及生理盐水对照组能刺激小鼠脾细胞产生更强的CTL杀伤作用以及更高水平的IFN-γ和IL-2；检测了各HTNV嵌合 VLP对HTNV感染小鼠的保护作用，CD40L-VLP和GM-CSF-VLP免疫后，用HTNV攻击小鼠，可有效减少小鼠脏器病毒抗原水平以及病毒RNA载量，减轻病毒感染带来的病理变化；对HTNV VLPs生物学活性进行了鉴定，三种HTNV VLPs分别有效地刺激了小鼠体外骨髓细胞向APC分化成熟，促进了小鼠体内及体外T、B淋巴细胞的增殖和活化，均显示其良好的生物学活性；通过对免疫小鼠血清中抗HTNV特异性抗体和中和抗体的检测，证实了HTNV VLPs比HTNV灭活疫苗具有更好的长效体液免疫效果，其中VLP-CD40L长效体液免疫效果最好。通过ELISPOT检测IFN-γ、IL-4分泌水平以及CTL杀伤实验证实，HTNV VLPs比HTNV灭活疫苗具有更好的长效细胞免疫效果。综上所述，本研究可为HTNV新型疫苗的研制奠定基础。

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