基于CRISPR的多位点组合调控技术的开发机制及其在甲羟戊酸途径中的调控研究

Metabolic engineering often starts on random regulations of the target pathway, followed by multiple rounds of design-build-test-learn cycles. The overall process is very time and effort consuming. The mevalonate pathway is an important metabolic pathway for producing a variety of terpenoids with significant commercial applications. Thus, based on the CRISPR based multiplex genome engineering tools we reported, through optimizing the binding region and activity of the Cas9 protein, the efficiency of the CRISPR activation domain, as well as the gRNA splicing efficiency of the CRISPR system, we aim to develop the CRISPR based combinatorial regulation system that allow precise control of individual gene expression of the mevalonate pathway based on their metabolic needs. The combinatorial regulation system should be an invaluable tool for yeast based metabolic engineering and synthetic biology.

目前构建微生物细胞工厂对目标产物合成途径相关基因需首先采取随机强度的激活或抑制，再通过多轮代谢工程改造实现对目标途径的精准调控和优化，整个过程费时费力。甲羟戊酸途径是生产多种高附加值萜类化合物的重要途径，对其通量水平和调控水平的优化具有重要的理论和实践意义。因此，本项目拟通过优化甲羟戊酸途径通量，研发出能够一步准确调控代谢通路中11个基因的表达水平、快速高效完成对目标代谢通路进行优化的方法。具体来讲，基于申请人前期开发的CRISPR多位点基因编辑系统，本项目拟进一步通过优化Cas9蛋白的识别区域和识别能力、CRISPR系统蛋白激活域的激活强度、CRISPR系统多靶点串联gRNA的剪切效率等，开发高效多位点多强度组合调控技术，找到目标途径相关基因表达的最优配比，实现对酿酒酵母甲羟戊酸途径通量的精准控制。本项目将为以酿酒酵母为基础的绿色生物制造提供更加有力的技术支持。

随着人们对细胞代谢途径改造的深入，如何平衡细胞产物产量与细胞生存压力，逐渐成为了在代谢工程领域和合成生物学中不可忽视的问题。本课题对本实验室开发的Lightning gRNA-tRNA-array CRISPR-Cas9（GTR-CRISPR）系统针对组合调控的应用进行优化，该系统能在3天内对酿酒酵母的6个基因进行敲除，同时敲除效率达到63%。为了能同时对酿酒酵母的甲羟戊酸途径中的多个基因进行调控，本课题通过针对gRNA阵列自剪切效率（tRNA）、CRISPR系统靶向范围（dCas9-NG蛋白）以及酿酒酵母多靶点的组装和调控效率（Lightning GTR系统）进行优化，实现对产β-胡萝卜素的酿酒酵母的甲羟戊酸途径的6个基因同时进行不同程度的激活表达和筛选，得到了能够让菌株的β-胡萝卜素产量提高10.9倍的基因表达组合。本论文开发的多靶点组合调控方法为合成生物学工具开发以及代谢工程系统改造提供了强有力的理论和技术支持。

内容获取失败，请点击重试