高效脂肪酶调控机制及性能强化的基础研究

对脂肪酶催化性能的认识、利用和开发是提高生物催化制备精细化学品过程效率的关键。本项以提高脂肪酶的“高效性”、“适用性”和“经济性”为目标，具体研究成果包括以下内容：.研究内容一：基于分子识别机制认知，改造脂肪酶空间结构。以脂肪酶的手性识别机制为研究重点，采用多种分子模拟方法用于定性和定量预测脂肪酶的手性选择性，首次揭示了脂肪酶对手性伯醇的分子识别机理，发现了脂肪酶对薄荷醇底物选择性的关键位点。在对脂肪酶变构机制的研究中，建立了系列蛋白修饰方法和表征技术，如蛋白化学修饰方法库、界面激活修饰方法等，以及MALDI-TOF肽指纹图谱表征方法、分子动力学计算修饰基团结构、折叠识别构建修饰后脂肪酶三维结构。针对脂肪酶催化反应过程遇到的稳定性和选择性这两个关键问题，开展了基于理性设计的分子改造工作，产碱假单胞菌脂肪酶的热稳定性和溶剂耐受性均提高1000倍，对薄荷醇底物的异构体选择性提高了10倍。.研究内容二：环境应答机制的脂肪酶催化强化原理。以手性化合物的动态动力学拆分反应为对象，研究了化学消旋催化剂与脂肪酶的生物相容性及调控策略，芳香醇和芳香胺的DKR反应体系温度分别降到25℃和55℃，eep值和转化率达到99%以上。针对脂肪酶的固定化问题，首次合成了核苷酸锆纳米材料用于脂肪酶固定化；设计了能快速从反应相中分离的磁性多孔聚合物；首次将离子液体用于修饰介孔材料载体。研究了多种酶催化的过程体系的性能强化，包括脂肪酶的非手性催化体系，如维生素C棕榈酸酯和1,3甘油二酯的合成；以及脂肪酶的手性拆分体系，如生物菊醇、左旋帕罗醇中间体等的手性拆分。.研究内容三：基于微生物生理代谢平衡控制高效合成脂肪酶。基于KEGG中的途径挖掘和整合，构建了脂肪酶的合成网络，定量分析主要代谢产物如有机酸和氨基酸等，计算胞内反应速率，获得代谢通量分布，揭示了枯草杆菌脂肪酶合成的物质代谢节点，脂肪酶的合成与天冬氨酸、谷氨酸、三丁酸甘油酯摄取速率正相关；与生物量、乳酸积累负相关。以三丁酸甘油酯为唯一碳源对菌株进行适应性进化，进化株的三丁酸甘油酯吸收速提高89%，脂肪酶活力提高51%。进一步通过双阶段溶氧策略引导胞内能量流的迁移，酶活比单一溶氧条件提高25%，稳定高效产酶6h，解决了枯草杆菌中脂肪酶产酶活力不稳定的问题，实现了脂肪酶的高效稳定表达。