运用代谢组学技术系统研究乌头碱类镇痛药的体内活性/毒性代谢产物

The systematic methodological nature of metabolomic techniques has significantly improved the discovery capability of in vivo drug metabolites, and consequently deepened our insight into the correlation between in vivo bioactivations and toxic mechanisms of some common drugs. Lappaconitine, crassicauline A and 3-acetylaconitine are the representative clinically using aconite analgesics. The systematic in vivo bioactivation mechanisms of them are not clear but quite crucial to understanding their non-narcotic analgesic effects and multiple toxicities. However, the potential multiple metabolic sites on their fused polycyclic structure lead up to great challenges of comprehensively discovering their complex and trace in vivo metabolites with classic protocols. In this regard, this work aims to systematically discover the in vivo bioactive metabolites of aconite analgesics in rats using metabolomic techniques in combination with multivariate similarity analysis, which was developed in our previous works in order for the discrimination of drug metabolites against the altered endogenous metabolites. The discovered in vivo metabolites of aconite analgesics are further to be comprehensively validated by in vitro metabolic assays, and some of the putative metabolites are to be identified by standard references prepared by experts in chemistry of diterpenoid alkaloids. It's believed that the results of the present work will not only systematically present the bioactivation pathways of lappaconitine, crassicauline A and 3-acetylaconitine, but also potentially contribute to the elucidation of network correlation between the in vivo biotransformation and efficacy/toxicity of them, and therefore provide guideline for their rational clinical uses as well as molecular design of novel aconite analgesics.

代谢组学技术的系统性方法学特征显著提升了药物体内活性/毒性代谢产物的系统发现能力，已阐明了某些经典药物长期不明的体内代谢制毒机制。高乌甲素、草乌甲素与乙酰乌头碱作为乌头碱类镇痛药的代表，其体内代谢活化/致毒机制是该类药物研究中非常缺乏却极为关键的环节；然而，其二萜生物碱骨架潜在多代谢位点，使得其体内复杂且痕量代谢产物的系统研究极具挑战性。由此，本项目拟运用代谢组学技术和我们发展的与其紧密衔接的多元相似性分析策略，系统并准确地发现乌头碱类镇痛药的大鼠体内代谢产物；然后通过综合的体外验证以及二萜生物碱化学专业人员配合的代谢位点鉴定研究，完成其体内活性/毒性代谢产物的发现、验证与鉴定研究。该研究结果不仅将系统呈现乌头碱类镇痛药的体内活性/毒性代谢产物，更有望为其体内复杂生物转化与毒性/效应的相关性提供极有价值的信息，从而为其效应与毒性机制的阐明、临床合理应用，以及药物分子设计提供重要的依据。

天然产物来源于自然界的生物系统，具有复杂的结构多样性和广泛的生物学活性，是新药发现的重要来源。正是由于天然药物复杂的化学结构和天然的生物系统相容性，它们在体内存在尤其复杂的代谢和转运过程，药代动力学研究极具挑战性。本项目以草乌甲素 (CSL)和银杏内酯B (GB)这两种化学结构复杂却已临床广泛使用的天然药物为对象，首次揭示了它们长期不明的一些极具特色代谢途径和代谢机制。.在CSL的代谢研究中，我们首先通过物质平衡试验证实，CSL静脉和口服给予大鼠后约80-90%的药物被代谢。然后，在CSL复杂的代谢途径中首次发现了C15-羟化代谢途径，并明确了至少2.0-3.5%的给药剂量经该途径代谢为3-去氧素馨乌头碱，一种已知的有毒二萜生物碱。通过肝S9成分体外代谢的桥接试验，我们进一步发现CSL在大鼠肝S9中的羟化速率显著高于人肝S9，由此说明该羟化代谢致毒途径在非临床研究中的贡献可能高于临床实践中的作用，因此应当谨慎评估CSL非临床PD/TOX数据的临床意义。本部分的研究结果基本达成了项目申请的目标，可为其效应与毒性机制研究、临床合理应用，以及药物分子设计提供重要的药代动力学依据。.在GB的水解代谢研究中，我们通过LC-MS/MS技术实现了GB和GA水解产物的色谱和质谱行为及结构鉴定研究，据此首次系统呈现了它们在生理环境和体内外的极具特点的水解代谢途径。在pH7.4缓冲液中，没有1-OH的银杏内酯A (GA)的三个内酯环均被水解，有1-OH的GB仅发生C环和F环的水解。GA在血浆中的水解过程与其在pH 7.4缓冲液中基本一致；而GB在血浆中发生独特的水解代谢，具体表现为：水解速率大幅增加, C环水解产物由于再次代谢而消失，并且该代谢途径并非酶催化反应过程，而可能与1-羟基和C内酯环形成结构域与内源性小分子代谢物的选择性反应有关。本部分的研究结果首次呈现了银杏内酯在体内的真实动态变化过程及其影响因素，初步揭示了其独特的化学结构与体内水解代谢之间的关系，从而不仅为其CNS药理作用机制的探索研究奠定了基础，而且为该类药物的分子设计和传递系统设计提供了重要的的依据。

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