层粘连蛋白受体第272位苏氨酸影响猪瘟病毒感染的分子机制

Virus entry is a key step in its replication cycle. We have shown that laminin receptor (LamR) is an attachment receptor for classical swine fever virus (CSFV), and the 272th threonine (T272) on the porcine LamR is different from those in other species in spite of the high conservation of LamR. CSFV infection can be inhibited significantly by mutation of T272. We speculate that T272 affects CSFV infection through promoting the LamR-mediated virus entry. Firstly, we will investigate the effects of T272 on the expression level of LamR, conversion from 37-kDa (precursor localized in the cytoplasm) to 67-kDa (mature isoform localized on the cell surface) LamR, and subcellular localization. Secondly, we will examine the effects of the mutation of T272 on the interaction between CSFV Erns and LamR and the adsorption of CSFV to the host cells. Finally, we will map the critical domain(s) as well as site(s) interacting with T272 and evaluate their possibility as potential targets for viral attenuation. This project will reveal the molecular mechanism of LamR T272 affecting CSFV infection and provide a new insight into precision breeding for disease resistance and virus attenuation.

病毒进入宿主细胞是其复制周期的关键环节。我们此前发现，层粘连蛋白受体（LamR）是猪瘟病毒（CSFV）的吸附受体，虽然其在不同物种间高度保守，然而猪源LamR第272位苏氨酸（T272）却表现出明显的差异，将其突变后显著抑制CSFV的复制。据此，我们推测，T272通过影响LamR介导的病毒吸附而促进CSFV的感染。首先，本项目将探究T272对LamR表达水平、37-kDa（定位于细胞内的前体形式）向67-kDa（定位于细胞膜的成熟形式）LamR的转化以及细胞定位的影响；然后，从病毒与宿主互作的角度明确T272突变后对CSFV Erns蛋白与LamR的结合及其介导的病毒吸附的影响；最后，确定与T272相互作用的Erns蛋白的关键结构域及位点并评估其是否能够作为致弱病毒的潜在靶点。本项目有望揭示LamR T272影响CSFV感染的分子机制，并为精准抗病育种及病毒致弱提供新的思路。

病毒进入宿主细胞是其复制周期的关键环节。我们此前发现，层粘连蛋白受体（LamR）是猪瘟病毒（CSFV）的吸附受体，虽然其在不同物种间高度保守，然而猪源LamR第272位苏氨酸（T272）却表现出明显的差异性，将其突变后显著抑制CSFV的复制。据此，我们推测，T272通过影响LamR介导的病毒吸附而促进CSFV的感染。67-kD的LamR是介导CSFV吸附的主要形式，然而，我们制备的针对LamR的抗体无法检测到67-kDa的LamR。因此，我们改变策略，继续筛选与LamR协同作用的细胞受体。利用表达Venus报告基因的重组CSFV以及针对猪源膜蛋白的sgRNA慢病毒文库，我们发现，转导包含针对MXRA8的sgRNA的慢病毒的细胞能够显著抑制CSFV复制水平，证明MXRA8可能是参与CSFV感染的宿主基因。通过小干扰RNA下调MXRA8的表达后，CSFV的复制水平显著降低，而过表达MXRA8基因后，CSFV的复制水平显著提高；利用免疫共沉淀试验、表面等离子共振以及激光共聚焦技术，我们发现，MXRA8蛋白与CSFV E2蛋白存在相互作用；同时，利用MXRA8的胞外域孵育细胞后能够显著抑制CSFV的复制水平，表明MXRA8是CSFV入侵宿主细胞的潜在细胞受体。本研究进一步丰富了CSFV入侵宿主细胞的分子机制，为猪瘟防控和开发抗病毒制剂提供参考。

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