开发细胞内融合基因技术解析海底硫酸盐型甲烷厌氧氧化菌群多样性

In marine sediments, large amounts of sulfate-reducing prokaryotes (SRP) and anaerobic methanotropic archaea (ANME) collaboratively carry out the bioprocess of sulfate-dependent anaerobic methane oxidation (SAMO), which is a critical step for carbon and sulfur biogeochemical cycles in marine ecosystem. However, due to the limitation of detection technologies, the total amount, diversity and abundance of each taxa in this process still largely remain unknown. Recently, a novel technique called epicPCR (Emulsion, Paired Isolation and Concatenation PCR) have been developed and open a new direction for functional taxa studies. Here in our proposal, we are going to improve this technique to disclose the functional taxa in SAMO process, by combining with high-throughput sequencing and bioinformatics approaches. The diversity, distribution, species interaction and decisive environmental factors will be well studied, and meanwhile the existence of a single species coupling both sulfur reducing and methane oxidation will be tested. In conclusion, this study could provide novel technique to reveal the important roles of SRP and ANME in SAMO bioprocess, which is especially important for carbon and sulfur cycles in marine ecosystem.

在海洋沉积物中发生的硫酸盐型甲烷厌氧氧化过程(SAMO)是海洋生态系统中碳、硫循环的重要步骤，目前的研究表明该过程由硫酸盐还原菌(SRP)与甲烷厌氧氧化古菌(ANME)协同完成，由于检测技术的局限，ANME和SRP功能类群的多样性和组成结构仍然大部分未知。最近一项名为epicPCR的新技术有效地在单细胞水平上进行了16S和dsrAB基因的连接，并通过对连接产物的高通量测序实现了SRP多样性的原位检测，为研究特定功能类群的分类多样性打开了大门。本项目拟通过改进该技术，同时结合高通量测序和生物信息学方法，来解析海洋系统中参与SAMO过程的微生物功能类群的多样性、分布特点以及群落中物种-物种、物种-环境的相互作用关系，同时探索是否存在能独立耦合SAMO过程的微生物。这一工作将为揭示海洋中生物地球化学循环的主要推动者，特别参与碳、氮、硫元素循环的功能微生物类群，提供新的研究方法。

甲烷厌氧氧化作用有效地阻止了海洋系统中的甲烷进入到大气圈，但其中的功能微生物——甲烷厌氧氧化古菌(ANME)难以培养和富集，人们目前对这类功能微生物类群的总体规模、物种丰度和分布状况依然大部分未知。本项目通过改进细胞内融合基因技术(epicPCR)，实现了在单细胞水平上分析功能微生物类群的多样性。首先通过16S rRNA基因与多种功能基因（dsrB、sul1、mcrA）的串联，验证了epicPCR技术在检测功能微生物类群方便的有效性和准确性。基于该技术，通过融合mcrA基因与16S rRNA基因，考察了南海冷泉区ANME的多样性，发现了除了已经被报道的携带mcrA的古菌，还有可能存在甲烷厌氧氧化的细菌。此外，还通过开发宏基因组技术，揭示冷泉区微生物群落功能多样性与结构特征。本项目成功证实了epicPCR技术在检测ANME功能微生物类群方面的有效性和灵敏性，为全面检测和认识海洋及其他生态系统中的ANME的多样性状况提供了有力工具，进而最终有望约束生态系统中甲烷的产生、消耗以及调控中的不确定性。

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