以γ-[18O4]-ATP为探针研究阿尔茨海默病中Tau蛋白过度磷酸化的动态变化

Alzheimer disease (AD) is known as an important neurodegenerative disease which mechanism is still not clear. Tau hyperphosphorylation is one hallmark of AD pathology and plays a key role in the development of AD. However, due to the complexity of Tau phosphorylation sites and isoforms, there is a urgent need to develop a systematic, convenient and quantitative method to monitor the dynamic change of Tau hyperphosphorylation that could facilitate the study on the interaction of multi-phosphorylated sites in Tau. Herein, we proposed using γ-[18O4]-ATP, a stable isotopic analog of normal ATP, as a probe to meet above requirement. Combined with mass spectrometry, liposome delivery technique and novel mathematic model, γ-[18O4]-ATP could be used to systematically identify pathological phosphorylation sites, distinguish native and pathological phosphorylation sites, measure the level of native phosphorylaltion of Tau and in vivo monitor the dynamic process of Tau hyperphosphorylation in AD.

阿尔茨海默病是一种重要的神经退行性疾病。目前，阿尔茨海默病的机理还不十分清楚，但Tau蛋白的过度磷酸化被认为在AD的发生、发展中扮演重要角色。由于Tau蛋白潜在的磷酸化位点繁多并存在多种组合形式，传统的基于抗体的逐点研究的技术难于满足对AD机理的深度理解，因此急需发展系统、便捷、定量地研究Tau蛋白多位点的磷酸化状态，跟踪各个位点间相互调控、动态变化的新技术。γ-[18O4]-ATP作为天然ATP的稳定同位素类似物，可在细胞内激酶的催化下，生成与正常磷酸化产物相差6Da的产物。结合脂质体包封技术，可以在保持细胞内其他功能蛋白活性、定位的前提下，向细胞内输送γ-[18O4]-ATP，原位地研究Tau蛋白的过度磷酸化行为。通过运用质谱技术和建立合理的数学模型，可以便捷地测定Tau蛋白的本底磷酸化水平并跟踪Tau蛋白过度磷酸化过程中的动态变化。

神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)目前的发病机理不清。发生AD的细胞中存在蛋白质的过度磷酸化，据推测与细胞的应激、细胞内ATP水平有关。本研究通过合成用于质谱定量的ATP稳定同位素探针，1）建立了基于稳定同位素探针和细胞内激酶信号放大方法测定细胞内ATP浓度的新方法；2）发展了低温诱导神经细胞Tau蛋白过度磷酸化的方法；3）发现过度磷酸化不仅存在于常规的O-磷酸化，还有因化学性质不稳定和长期被忽视的N-磷酸化。. 我们通过质谱发现，真核细胞内存在大量的未被研究N-磷酸化，例如pHis, pArg等。其中pHis的研究被诺贝尔奖得主Tony Hunter在2016年率先报道。依托本课题，我们课题组在pArg领域取得突破。我们制备并报道了世界首个高灵敏度、高特异性pArg抗体，报道该抗体的文章成为RSC 2016年阅读和下载前5名；通过使用抗体并结合质谱研究，我们首次发现真核细胞内存在大量的pArg位点；结合国际上对蛋白质N-磷酸化研究的热点，我们合成了一系列N-磷酸化氨基酸类似物，建立了一系列蛋白质N-磷酸化研究方法、新技术，如：1）我们发展了新的pHis多肽制备方法，研究了pHis的稳定性与等电点等物理化学性质；2）优化了细胞内酸不稳定磷酸化（pHis/pLys/pArg）的蛋白质组学研究流程；3）发展了多种 pHis和pArg类似物，系统研究了这些类似物的物理化学性质。通过本研究，我们建立了完整的研究蛋白质N-磷酸化的研究体系，包括：各种pHis/pArg相关的酶、质谱和色谱标准品、研究蛋白质N-磷酸化的小分子探针与抑制剂、调控细胞内N磷酸化水平的方法等。利用上述的抗体和研究体系进行筛选，首次发现在真核细胞中存在大量的pArg蛋白。通过系统的优化蛋白质学实验流程，首次在真核细胞内大规模的鉴定了152个pArg位点，推测了其磷酸化简并序列及可能的生物学功能；首次发现应用小分子探针，可以调控神经细胞、肿瘤细胞中的N-磷酸化水平。. 通过本课题的研究，我们与国际上研究N-磷酸化的小组建立了广泛的联系、交流和合作，与国内多家单位开展合作研究，期望借助化学与生物学之间的学科交叉，共同推进N-磷酸化在中国的研究，并希望在这一新兴的领域取得原创性、突破性的进展。

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