宁夏枸杞低自交结实率的发生机制研究

Lycium barbarum is one of the main cash crops in NingXia Hui Autonomous Region. Some cultivated varieties has good characters when mixed cultivation, but has low fruitful rate when uniform variety cropping. In order to explore the inner mechanism, the breeding system, cellular and molecular mechanisms of different cultivated varieties with different self-fruitful rate were studied. In our past studies, the flowering characteristic, the breeding system, pollen tube germination and growth were analyzed and S-RNase and SLF genes were cloned. On the basis of our past results, we will compare the variation characteristics and differences in different phases from self- and cross-pollination to fertilization using light microscope, electron microscope by tissue section technique. Further to clone the S-RNase and SLF genes from different cultivated varieties, and analyzed the genes polymorphism and tissues differential expression. To study the interaction between S-RNase and SLF, SLF and ubiquitin using yeast two hybridization. And to study the binding between SLF and 26S proteasome using co-immunoprecipitation assay with or without the inhibitor in vitro. Then we will study the effects on self-incompatibility by changing of S-factor ploidy using chromosome doubling technique. The research will provide new research ideas and theoretical evidences on self-incompatibility, be beneficial to breeding research on Lycium barbarum.

枸杞是宁夏主要经济作物之一，然而枸杞许多品种在单一栽培时结实率低下，严重制约枸杞产业的发展。本项目以自交结实率不同的宁夏枸杞不同品种为研究材料，在前期繁殖生态学、自交亲和性分析、和S-RNase及SLF基因克隆和多态性分析的研究基础上，利用切片和显微镜技术研究宁夏枸杞不同品种大小孢子发育和雌雄配子体发生过程，不同授粉后花粉管生长规律、线粒体细胞核结构和形态变化分析及合子发育过程分析；利用免疫定位技术研究S-RNase和SLF的分布和含量，酵母双杂交技术研究S-RNase和SLF的相互作用及SLF与泛素分子的相互作用，26S蛋白酶体抑制剂研究S-RNase的降解是否经过26S蛋白酶体的作用；通过染色体加倍，研究S因子倍性改变对自交不亲性识别的影响。从形态学、细胞学和分子生物学角度研究宁夏枸杞低自交结实率发生的机制，不仅从理论上丰富自交不亲和性的研究，对宁夏枸杞的育种实践也具有指导意义。

由于自交不亲和的存在，许多枸杞新品种在单一栽培时结实率低下，制约枸杞产业的发展。项目以自交结实率不同的宁夏枸杞不同品种（宁杞1号、宁杞6号和宁杞8号）为研究材料，从繁殖生态学、细胞学和分子生物学角度研究宁夏枸杞低自交结实率发生的机制。.首先标记并观察三个品种花部特征和开花动态，花粉活力和柱头可授性在三者之间并没有表现显著区别；授粉实验表明宁杞1号为自交亲和品种，宁杞6号和8号为自交不亲和品种，并且染色体加倍一定程度上提高了宁杞6号的自交亲和性。.引导组织是花粉管生长的通道，通过对花柱不同部位横切面切片观察，随着切片部位逐渐向子房端靠近，三个品种中，授粉和未授粉花柱的引导组织占花柱面积的比例均逐渐减少，但三者之间无显著差异；苯胺蓝染色结果表明无论自交或异交，各个品种的花粉均可萌发并生长，但自交授粉的花粉管在花柱引导组织内的生长受到抑制。宁杞6号小孢子发生及雄配子体发育与宁杞1号无明显不同，发育正常，花粉结构和功能正常，无败育现象。.通过基因克隆，确定了各个品种的S基因型：宁杞1号为S2S8，宁杞6号为S2S5，宁杞8号为S1S2；目前为止，得到7个全长S-RNase序列，这7个基因序列长度从645bp到672bp，编码蛋白长度214到223个氨基酸，蛋白序列比对结果表明，这些S-RNase蛋白的氨基酸序列含2 个高变区和 5 个保守区，2个保守组氨酸，7个保守半胱氨酸，及N端均有一段约20个氨基酸编码的信号肽。定量PCR结果表明，S-RNase基因在‘宁杞8号’花柱中特异表达。克隆得到两个完整的SLF的序列。酵母双杂交实验结果表明，S5-RNase蛋白和SLF1及SLF2没有发生相互作用。花粉管体外萌发实验表明，不同花柱蛋白提取液会抑制相应不亲和组合的花粉管的萌发和生长。杂交群体S基因型分析说明枸杞中由 S-RNase 指定的 S 基因型以配子体形式和 S 单体型共分离。除此之外，S基因型分析结果还表明，S8-RNase所指定的S8基因型是自交亲和突变。

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