基于单倍型数据的人类线粒体DNA异质性突变研究

Mitochondrion is an organelle generating most of the cell’s ATP. DNA located in mitochondrion is called mitochondrial DNA (mtDNA). MtDNA mutation could have an effect on organism metabolism and leads to many diseases, such mutations are normally in hetreoplasmy status (coexistence of wildtype mtDNA and mutant mtDNA). Investigation of the mtDNA genetic variations has always been a hot topic for scientists and clinicians. However, most previous studies were applied on single mutation, the possible association/epistasis between different mutations was overlooked. With the development of next-generation sequencing technologies, multiple low-level heteroplasmic mutations were identified in a single individual, it is urgent to know whether these mutations are randomly located on different mtDNA molecules or clustered on some specific molecules, which is crucial for understating the mutagenesis, estimating the mutation load, and predicting the risk. In this study, we aim to create the first intra-individual mtDNA haplotype map by integrating the next-generation sequencing data and the third-generation sequencing data. Moreover, we will demonstrate the process of occurrence, fixation, and transmission of the mtDNA mutation in the context of haplotype. Meanwhile, taking the advantage of the higher resolution provided by haplotype in tracing the origin of mtDNA, we will review some of the most debatable questions in the field of mtDNA, e.g., whether paternal leakage and recombination occur during the inheritance of mtDNA.

线粒体是细胞内合成能量的主要场所，其中含有的遗传物质被称为线粒体DNA，其上发生的突变可以导致多种疾病的发生，而这种突变往往处于异质性状态（野生型线粒体DNA与突变型线粒体DNA共存）。对线粒体DNA遗传变异的研究，一直是领域内的热点。然而，之前对异质性突变的研究主要以单个突变为对象,突变之间可能存在的连锁效应一直被忽视。随着技术的发展，越来越多的异质性突变被发现，他们是随机的发生在不同的线粒体DNA上还是集中发生在一些特定的线粒体DNA上，对于了解突变发生过程、计算突变负荷、风险评估至关重要。在本研究中，我们将通过整合第二代与第三代测序数据的方法，首次构建个体内线粒体DNA单倍型遗传变异图谱，从一个全新的角度来阐述突变的发生、发展与传递规律。同时，由于单倍型数据在溯源分析中可以提供更高的分辨率，我们将尝试回答一些线粒体DNA遗传变异中尚有争议的难点问题，例如是否存在父系遗漏及重组现象。

线粒体是细胞提供所需能量的主要来源，同时拥有自己的基因组（mtDNA）。线粒体DNA突变与线粒体疾病有关。然而，由于二代测序技术读长的限制，当线粒体DNA上存在多个突变时，我们无法直接获得突变的连锁信息，这给线粒体DNA突变与传递规律研究带来了挑战。本研究开发了线粒体DNA全长单倍型三代测序技术，通过一对PCR引物扩增全长线粒体DNA，富集后文库中全长线粒体DNA片段超过90%。此外，通过添加标签序列的方法，我们可以在一个Pacbio芯片上对多份样本进行线粒体全长测序，从而大大降低了测序成本。该方法获得的线粒体DNA一致性序列及突变与传统二代测序方法高度一致，证明了其可靠性。在此基础上，我们完成了迄今为止规模最大的线粒体单倍型全长测序（143例），发现线粒体DNA突变间存在显著的连锁不平衡现象，其强度与突变间的距离并无显著相关性。随后，我们研究了线粒体DNA在传递中的频率变化，发现线粒体DNA单倍型传递的变化与单个突变传递变化存在显著差异。在计算传递中“瓶颈期大小”时，通过突变计算得到的值会比真实值偏大（24，14）。我们还首次从单倍型的视角研究了线粒体DNA的重组与“父系遗漏”，揭示了样本内线粒体DNA间可能发生低水平的重组事件。在50多次的传递事件中，我们并未发现“父系遗漏”信号，提示其发生率较低或不发生。此外，我们还完成了当前最大规模的多世代（4个世代）线粒体DNA传递研究，发现多数线粒体DNA突变在传递过程中未受到明显的选择作用，其频率变化在世代间传递主要受到随机漂变的影响。在肿瘤样本中，我们首次证明同一肿瘤不同部位线粒体DNA存在显著差异，且差异与空间位置相关，其突变模式与癌旁组织并无显著差异，这表明肿瘤内线粒体DNA未受到强烈的选择压力影响。本项目为线粒体DNA遗传变异研究提供了新的方法与思路，相关结果加深了我们对线粒体DNA遗传变异规律的理解。

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