基于FACS的AT1R偏向性激动剂的超高通量筛选

Biased agonists at GPCRs can activate downstream signaling events in a selective manner. Due to enhanced drug efficacy and reduced on-target adverse effects, great attention has been addressed to biased agonism in both academia and industry. But, the discovery and optimization of biased agonists are largely restrained by the limited throughput of screening methods. Angiotensin II (AngII) and angiotensin II receptor type 1(AT1R) are two very important therapeutic targets for cardiovascular diseases, and β-arrestin-biased agonists targeting AT1R have been proved to be extremely beneficial in the treatment of heart failure. Using AngII/AT1R as a model system, we have developed a FACS-based ultrahigh-throughput screening system for the discovery of biased AT1R agonists. Using this system, the structure-function relationship of AngII on downstream activation of AT1R signaling will be studied, and the possibility of discovering novel biased AT1R agonists will be further explored. We envision that the system can not only be utilized for structure-function relationship study of proteins and peptides, but also generally facilitate early discovery of peptide agonists/antagonists at GPCRs.

GPCR偏向性激动剂通过选择性激活GPCR下游某些特定的信号通路，以提高药物药效、降低用药副作用，近年来受到广泛重视。然而，偏向性激动剂的筛选通量有限，极大地限制了其发现和优化。血管紧张素II（AngII）和血管紧张素1型受体（AT1R）是心血管疾病治疗中的重要靶点，而AT1R的β-arrestin偏向性激动剂在心力衰竭治疗上具有很大的潜在应用价值。以AngII和AT1R为模型，我们的前期实验证明了开发AT1R偏向性激动剂超高通量筛选系统的可能性。我们计划进一步应用这个系统，研究AngII激活下游信号途径的构效关系；并在已有偏向性激动剂的基础上，发现新的AT1R偏向性激动剂。这种基于FACS的超高通量筛选系统不仅可以用于多肽、蛋白的构效关系研究，还将有助于其他各种GPCR的多肽激动剂/拮抗剂的早期发现。

G蛋白偶联受体是人类基因组中最大的一类细胞表面受体，约含800~1000个成员。所有的GPCR拥有相似的七次跨膜螺旋结构，根据序列的相似性可分为5个主要的亚家族。可以说，GPCR是最为重要的一类药物治疗靶点，目前30~50%的临床药物以GPCR为靶点。AT1R是目前研究最为深入的GPCR靶点之一。本研究拟通过开发一系列的蛋白质工程技术手段，以加速GPCR激动剂的发现并由此高通量筛选AT1R的偏向性激动剂，激活该受体下游某些特定的信号通路。.为了实现AT1R的激动剂的高通量发现，我们构建并验证了AT1R过表达的β-arrestin 募集报告细胞系，AP-1 报告细胞系的有效性。在此基础上，我们把AngII通过N端或者C端展示，锚定在报告细胞系的细胞膜表面，发现这种基于自分泌系统的多肽展示会造成比较严重的非特异信号。有鉴于此，我们尝试了构建过表达AT1R的细胞系，以用于从天然抗体库中筛选AT1R偏向性激动的抗体分子，然而并没有取得成功。究其原因可能有两方面的因素导致筛选方案的失败：1.天然抗体库中没有针对AT1R的激动型抗体分子；2.由于AT1R的胞外段很短，第一步噬菌体展示淘选针对原位AT1R的难度较高，导致淘选失败。.尽管如此，我们仍然通过这个项目开发和优化了一些蛋白质工程和抗体筛选的技术手段：1.基于蛋白片段互补分析技术的一种高通量表征蛋白连接酶底物谱的方法；2.基于信号肽改造的哺乳动物细胞表面展示技术优化方案；为今后开发功能性多肽、蛋白分子夯实基础。

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