一种用于生物分子多重检测的微加工图形编码悬浮芯片阵列

Massive parallel processing of samples and analytes stands long as a major goal of technology development for biological signal detection.However, whilst the limits of these two dimensions are constantly pushed forward by "sample high-throughput" products like microplates and by "analyte high-throughput" products like microarrays and sequencing, researchers now find themselves being short of reliable tools for assaying substantial amount of samples with 10-1000 plex indices per sample; which coincidentally manifests the urgent need for efficient quantitative assays from multiple disciplines such as omics study, biomarker validation, molecular diagnostics, and drug screening, etc. Using analyte-addressable, physically-coded microbeads as assay units, suspension arrays show great potential to accomplish the quest of parallel detection of multiple indices within a single micro reaction volume, due to their superior performances in multiplexity, sensitivity, reliability, and scalability. Yet current solutions still bear defects in material, structure, fabrication, instrumentation or decoding methods.This application proposes a novel scheme using the optical transmittance pattern created by high-reflection dielectric coating as a 2-D graphical code for suspension array beads. Mass-produced via well-established microfabrication technology, these purely inorganic and non-metal beads are simply structured, cost-effective, and easy to apply surface modification, plus excellent reproducibility.As a proof-of-principle, this assay system will be tested using the multiplex biomarker panel for type 1 diabetes mellitus.

生物信号检测技术一直在向样品和分析物的大规模并行处理方向发展。然而，在以微孔板为代表的样本高通量产品和以微阵列、测序技术为代表的分析物高通量产品不断推进这两方面分析能力提升的同时，人们发现缺乏可靠的技术来应对组学研究、生物标识物验证、分子诊断、药物筛选等领域中对大量样品进行10-1000重并行检测的需求。悬浮阵列技术使用编码微珠作为检测载体，具有多重性、灵敏度、可靠性、扩展性等诸多优势，显示出解决"在单个微量反应体系内并行检测多个指标"问题的潜力。但现有各种方案在材料、结构、制备、仪器及解码方式等方面尚存在不足之处。本项目提出利用高反射介电镀层作为编码物理结构、通过镀层和基底间光学透射率的差异对悬浮芯片进行二维图形编码的方案。该芯片只含无机非金属材料，可采用成熟的微加工技术大量制造，结构简单、成本低廉、易于修饰，具有优异的可重复性。作为原理性验证，我们将用其检测1型糖尿病的多重生物标识物。

进入精准医学时代，临床治疗决策、药物效能评估等关键判断将基于对多个而非单一分子标识物的并行分析而做出。作为一种物理寻址（芯片编码对应分析物身份）的液相阵列，悬浮芯片能够在单个反应体系中完成多指标检测，在极大提高检测通量和效率的同时，显著节省了标本和试剂；且相对于传统固相阵列其悬浮运动特性带来的反应动力学优势更有利于提升检测灵敏度，因此已成为多重生物检测的首选技术。目前，主流商业化产品多采用荧光发射谱编码微球结合流式设备检测，存在荧光淬灭、光谱重叠、微球合成的批次差异、以及流路的清洗维护等一系列技术和应用难点。..我们研究团队针对现有平台的局限性，结合微纳加工工艺和计算机图像识别技术设计了一种基于二维图形编码的悬浮芯片，其编码结构采用多层介电高反射镀膜，其光学图像具有高对比度，可被图像识别软件自动化处理。得益于成熟的半导体工艺，芯片大规模制造成本低廉，不受荧光发射谱重叠和光漂白效应的影响。检测时使用常规的高通量成像设备即可自动化获得数据。以此编码悬浮芯片为核心载体，我们进一步开发了基于标准微孔板的高通量检测方法，并形成了包括试剂耗材、检测操作、仪器设备、数据分析处理等在内的成套体系。..本项目通过微加工工艺制备了可达128重编码的硅基悬浮芯片（单张6寸晶圆产量达3千万片）。所开发的配套软件对芯片解码正确率达99%，并可自动完成信号提取和数据分析。对4种蛋白分析物 (TNFα, IFNγ, IL-1β, FGF-19) 进行的多重检测显示，本项目研发的悬浮芯片灵敏度最高可达亚pg/ml水平，检测动态范围接近4 logs, 非特异性吸附和交叉反应可忽略。精密度（数据重现性）和稳定性（基质效应和稀释效应）达到商业化产品同等水平。通过对1型糖尿患者血清中3种自身免疫抗体标识物（GADA, IA-2A, ZnT8A）的多重检测，评估了该技术在临床诊断领域的应用潜力。此外，还进行了针对microRNA以及HPV病毒基因等核酸标识物的多重检测，展示了本项目成果可以灵活满足多种应用需求，是一种具有优良通用能力的平台性技术。

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