可用于疟原虫基因功能分析的新型条件性基因敲除技术的研究

Malaria is one of the most severe infectious diseases affecting millions of people annually in the world. Although the genome sequences of malaria parasite, Plasmodium spp, were elucidated a decade ago, the functions of most genes involved in many important biological processes of this parasite have not been determined. Gene knockout technology, a method extensively used for gene function study, has limited use in the blood stage haploid parasite to characterize the negative dominant genes. Here, we propose to combine the tetracycline-regulated gene expression system and gene knockout method to establish the conditional gene knockout system in Plasmodium for study of gene function of the parasite. In the preliminary study, we have successfully established tet-on system which can regulate expression of reporting gene (GFP) efficiently in the blood-stage of Plasmodium berghei. We will pursue further to use this gene conditional knocking out technology to characterize and determine the functions of a panel of endogenous genes that might be involved in the development, differentiation and multiplication of the parasite. This technology will be of importance for studying the biology of the parasite and may contribute to identify important genes which have potential for anti-malaria drug and vaccine development.

许多与疟原虫生长、发育相关的重要基因具体功能目前尚不明确，阻碍了抗疟疫苗和药物的研发。基因敲除是目前研究疟原虫基因功能的主要方法，但对单倍体红内期疟原虫，重要功能基因的缺失导致虫死亡而无法研究基因功能。我们拟运用基因调控系统与基因敲除技术在疟原虫建立条件性基因敲除技术。四环素诱导系统(Tet-on/Tet-off)是用于条件性基因敲除最合理的基因调控系统。前期研究中，我们已在红内期疟原虫成功建立了能准确发挥基因调控作用的Tet-on系统，以及相关技术和条件。在此Tet-on系统基础上，我们将探索研究疟原虫基因条件性敲除（如Berghepain、LplA1、DHODH等基因），并对转基因疟原虫的表型变化进行多方面检测、对比分析和综合评价，以确定目的基因功能。此项基因功能研究技术的建立对深入了解疟原虫这一重要人类传染病病原生物学特征有重要应用价值，并可极大促进抗疟药物和疫苗的研发。

疟原虫基因组测序工作已完成，大量与疟原虫生长、增殖和入侵宿主的重要基因具体功能有待阐明。目前研究疟原虫基因功能的重要方法是基因敲除，但对于大部分生长期为单倍体的疟原虫，重要功能基因的缺失导致虫死亡而无法研究基因功能。我们运用四环素诱导基因表达调控系统(tet-on)与基因敲除技术相结合在小鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei红内期成功建立了新型条件性基因敲除系统/技术；利用该系统我们条件性敲除了疟原虫重要基因HT1，HXGPRT，OMD与LplA1，获得了转基因伯氏疟原虫单克隆虫株，并重点对HT1与HXGPRT基因条件性敲除的转基因疟原虫的表型变化进行多方面检测与分析，确定基因功能；此外，在诱导剂无水四环素(ATc)缺失条件下，我们观察到HT1基因条件性敲除的转基因疟原虫表现为自我限制性感染过程，并可诱导极强的免疫保护力，显示此种遗传缺陷疟原虫作为遗传减毒全虫疫苗的可能性，尤其此种遗传修饰疟原虫可以在有诱导剂条件下大量扩增，解决了以往遗传缺陷疟原虫无法保种、传代的难题。本项目建立的新型基因功能研究技术对深入了解人类重要传染病病原——疟原虫的生物学特征有重要意义和应用价值，将促进抗疟药物和疫苗的研发。

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