新型Hsp90抑制剂X66抗肿瘤作用分子机理研究

Hsp90 is an important regulator of tumor cell proliferation, apoptosis and differentiation . Thus, it is a target of promising antitumor drugs. Although these Hsp90 inhibitors in clinical trial showed antitumor activity, simultaneously stimulated the heat shock response, accompanied with the increased level of stress-inducible proteins such as Hsp70. This results in the significant decrease of antitumor activity of Hsp90 inhibitor. X66, a small molecular compound, discovered by computer-aided drug screening against Hsp90, induced the degradation of many client proteins which involved in tumor development and progression, and inhibited the proliferation of cancer cell lines. However, X66 did not induced Hsp70 expression and abrogated the upreguration of Hsp70 induced by geldanamycin, a classical Hsp90 inhibitor. All these indicate that X66 is a new type of Hsp90 inhibitor. In this project, using molecular and cell biology methods, we will study the molecular mechanism of Hsp90 and Hsp70 regulated by X66; synthesize new compounds which act as small molecular probes studying the role of Hsp90 in the signal transduction pathways and in tumor development and progression; develop a new class of Hsp90 inhibitors as antitumor drugs.

Hsp90是调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等细胞功能的重要蛋白，因此，Hsp90抑制剂是非常有前景的抗肿瘤药物。目前进入临床试验的Hsp90抑制剂在抗肿瘤作用同时，激活热休克应激反应，诱导Hsp70等应激蛋白的表达，极大降低了抑制剂的抗肿瘤疗效。我们通过计算机虚拟筛选技术发现了小分子化合物X66，该化合物降解多种与肿瘤发生、发展相关的Hsp90客户蛋白；抑制肿瘤细胞增殖；但不诱导Hsp70表达；并能抑制经典Hsp90抑制剂geldanamycin诱导的Hsp70表达，提示X66是一个新型的Hsp90抑制剂。本项目将运用分子和细胞生物学方法研究X66抑制Hsp90的分子机制；阐明X66不诱导Hsp70的机理；合成新的活性更强的Hsp90抑制剂；并以该类化合物作为小分子探针研究Hsp90的信号转导机制以及与肿瘤发生发展的关系；远期目标是发展一类新型Hsp90抑制剂作为抗肿瘤药物。

Hsp90是调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等细胞功能的重要蛋白，因此，Hsp90抑制剂是非常有前景的抗肿瘤药物。目前进入临床试验的Hsp90抑制剂在抗肿瘤作用同时，激活热休克应激反应，诱导Hsp70等应激蛋白的表达，极大降低了抑制剂的抗肿瘤疗效。本研究中，我们详细研究X66的抗肿瘤作用机制，包括与HSP90的结合方式、对客户蛋白的作用、对细胞周期及凋亡的影响，并全面评价其体内外抗肿瘤作用。结果显示，X66具有广谱的抗肿瘤活性；与HSP90 N端结合，抑制蛋白的ATPase活性，进而引起客户蛋白降解，诱导细胞周期阻滞及凋亡，产生抗肿瘤作用。此外，我们还研究X66不诱导HSR反应的原因，发现X66不激活HSR反应的关键转录因子HSF-1 (heat shock factor-1)，因而不诱导热休克反应蛋白的表达。X66与HSP90-蛋白酶体双重抑制剂雷公藤红素 (celastrol) 联合作用，在体内外产生协同抗肿瘤作用。该协同作用可能是由于X66逆转celastrol诱导的HSR而产生的。.另外，我们采用大肠杆菌表达系统表达纯化人源和具有激酶活性的酵母HSP90，构建了HSP90抑制剂分子水平筛选模型，包括ATPase活性实验及荧光偏振 (Fluorescent polarization, FP) 实验。通过计算机模拟，我们获得一系列可能结合在N端的ATP位点的化合物。通过构效关系研究，利用上述两种筛选模型，我们对这100多个化合物的活性进行了检测，发现了数个具有较强HSP90抑制活性的化合物，与X66不同，其中化合物DCZ112对乳腺癌有较好的选择性。.综上所述，我们对新型HSP90 N端抑制剂X66的药理学活性进行了系统的研究，揭示了该化合物同时具有抗肿瘤作用和不诱导HSR的特性。此外，通过逆转HSR，X66与HSP90抑制剂和蛋白酶体抑制剂联合应用产生协同抗肿瘤作用。因此，我们为HSP90抑制剂的开发及克服其临床耐药提供了新的思路，并为联合用药的策略提供了实验基础，具有明显的学术价值和临床意义。

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