心脏发育相关重要转录因子NKX2.5和GATA4等的调控区的分析及其变异影响先心发生的功能研究

Congenital heart disease is a common defect with an incidence of about 0.8 percent. NKX2.5, GATA4 and many other heart/CHD related genes interact with each other to form a complex regulatory network. Imbalance of the network is an important contributor of CHD. Mutation in coding regions of these genes can explain half of congenital abnormal cause, while the other half etiology remains unknown. Regulatory elements of genes play an important role in the spatiotemporal and quantitative expression of the target gene. In previous studies, applicant has found that mild decrease in TBX20 promoter activity is a potentially protective factor against CHD in the Han Chinese population. Moreover, several heart-specific enhancers near heart-related genes have been identified by applicant. Consequently, we assumed that variation in regulatory elements in cardiac related genes is another important pathogenic factor. Based on this hypothesis, we proposed 1) to screen functional regulatory elements in the range of 250kb upstream and downstream of genes which plays important roles in heart formation; 2) to analyze and validate the regulatory regions' function in cell culture and zebrafish which include target gene regulation and mutation influence on heart development; 3) to screen and functionally validate disease-related mutation in regulatory elements of CHD patients based on our large sample library. It can be expected that new evidence of regulatory elements mutations in congenital heart disease will be identified, which will provide a new path for intervention of CHD occurrence.

先天性心脏病是发病率约8‰的常见缺陷性疾病。NKX2.5、GATA4等心脏发育相关基因互作形成复杂调控网络，其失衡是导致先心发生的重要原因。这些基因编码区的异常可解释半数先心病因，但仍有半数病因不明。基因调控区功能与目标基因表达时空量效密切相关。申请者前期发现，TBX20等先心相关基因近端启动子区的变异与先心易感性相关；并在距离先心相关基因数百kb范围内鉴定出多个可使基因在心脏特异表达的增强子。故我们认为，心脏发育相关基因的调控区变异可能是又一重要致病因素，深入研究意义重大。基于这一假设，我们拟1）以NKX2.5、GATA4等心脏发育关键基因为切入点，在基因上下游250kb范围内筛查调控区；2）在细胞和斑马鱼中进行功能研究：分析调控区对靶基因的调控及其变异对心脏发育的影响；3）基于我院大量先心临床资源，筛选调控区突变并功能验证。预期为先心病因提供调控区变异证据，并为干预先心发生提供新路径。

研究背景：先天性心脏病是常见的先天缺陷性疾病，全球发病率约为8‰，心脏发育相关基因形成的复杂网络调控失衡是导致CHD发生的重要原因，基因编码区异常可以解释部分CHD不病因，但仍有半数以上病例病因不明，非编码区尤其是已知基因的调控区变异成为新的遗传致病因素受到关注，但研究有待进一步深入。.研究内容： 本研究从诊断、预防、干预的需求出发，依托生物信息学分析，以NKX2.5、GATA4 等基因调控区筛选为切入点，基于细胞和斑马鱼进行系统的功能分析，从而高效筛选、分析、鉴定出新的调控区潜在致病因素。.重要结果：1.成功构建了一套生物信息学分析工作流，实现在全基因组范围单碱基水平对每个调控区与心脏的相关性进行评估和量化，构建了一个CHD-RPanel，筛选了多个心脏核心基因的调控区和功能相关的转录因子，构建了转基因斑马鱼模型；2.成功确立了调控区和靶基因的关系，发现CHD相关基因周围保守和不保守的心脏调控区对心脏/心肌细胞功能的重要作用。.关键数据：1.基于比较基因组学分析，在全基因组范围内筛选出69182个进化保守区，约占整个人类基因组的4%；2.基于ChIP-seq数据筛选、收集，在全基因组范围内筛选出48923个区域，约占人类基因组的0.1%；3.结合328个心脏发育/CHD相关基因，构建了一个 3.3MbCHD-RPanel，包括2.2Mb心脏重要性调控区、2.2Mb心脏特异性调控区和0.3Mb人类特异性调控区；4.以心脏核心基因NKX2.5、GATA4等基因为研究对象，在基因周围筛选出了多个心脏特异性调控区，构建了相应的转基因斑马鱼，通过凝胶迁移实验和染色质免疫共沉淀分析鉴定了转录因子与调控区的互作关系，通过CRISPR/Cas9基因敲除技术明确了调控区和靶基因的关系；5.通过在细胞和分子水平的功能研究，发现人特异性调控区敲除对人心肌细胞的增殖、凋亡、相关靶基因以及通路基因的表达具有重要影响。.科学意义：1.在体外和体内，明确心脏发育调控网络核心结点基因NKX2.5、GATA4等的调控序列和调控因子在CHD中的功能作用，为CHD的遗传病因研究和机制研究提供新思路；2.筛选CHD相关的调控序列或转录因子变异，为临床分子诊断提供新线索，建立高效分析疾病相关非编码区内潜在致病位点的研究路径。

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