利用三维单分子荧光跟踪技术研究单细胞内三维扩散分布及凋亡的影响

Not only the intracellular macromolecule diffusing dominates the cellular activities, but also reflects the characteristic of the crowding micro-environments in cells. Therefore, the how to accurately measure the intracellular diffusion coefficients is always drawing attention to the scientific researchers. However, due to the limitation of the traditional techniques by which only the diffusion coefficient of one point in the cell could be measured once, until now there is no information about the diffusion of macromolecule in the truly three-dimensional (3D) space in cells, and particularly the 3D diffusion map. In the research proposal, we aim to develop a novel method to map rapidly the 3D diffusion distribution in single cells, based on our previously two-dimensional mapping method. To this end, we will build 3D single-molecule fluorescence tracking platform, by setting up the z-axis detecting and objective focus locking equipments. And from the 3D trajectories of the single fluorescence molecules in the cell, the 3D diffusion map of the single cell can be calculated directly. Using this method, we will study the 3D diffusion map in apoptotic cells, and focus on the local diffusion characteristic around the mitochondria when releasing the signal molecules, and that during the formation of apoptotic bodies. By using the precise measurement of the 3D diffusion map, we will elucidate the dynamic characteristic of the intracellular macromolecules during apoptosis, and analyze the effect of apoptosis on the intracellular micro-environments. This work will shed new light on the mechanism of apoptosis in the view of biophysics.

生物大分子的扩散支配了细胞内的生命活动，也反映了细胞内拥挤微环境的特点，因此细胞内扩散速度的准确测量在长久以来都受到研究者的关注。但是，由于传统方法仅能每次测量细胞上单个位点的扩散，目前人们并不清楚生物大分子如何在真实的细胞内三维空间中进行扩散,特别是扩散在细胞内的三维分布。在本项目中，我们将在过去二维扩散测量技术的基础上创立一种快速测量单细胞内三维扩散分布的新方法，即通过搭建轴向测量和物镜锁焦装置，建立三维单分子荧光跟踪平台，然后由细胞内的单分子荧光运动轨迹，直接计算单细胞内的三维扩散分布。利用该技术，我们将研究凋亡对细胞内三维扩散分布的影响，以及线粒体释放凋亡信号分子和凋亡小体形成过程的局部扩散特征。我们将通过对三维扩散分布的精确测量来阐明凋亡细胞内生物大分子的动力学特点，并深入分析凋亡对细胞内微环境的影响，从而在生物物理角度进一步理解细胞的凋亡机制。

生物大分子的扩散及输运动力学支配了细胞内的生命活动，因此长久以来都受到研究者的关注。但是，由于当前实验测量手段主要局限于二维成像，人们并不清楚生物大分子如何在真实的细胞内三维空间中进行扩散输运，及其在重要生物过程如凋亡中的动力学特征。本项目中，我们依照项目计划书，顺利开展了三维荧光成像平台的研制，以及单细胞内三维扩散动力学的相关研究。圆满完成了本项目的研究目标，获得了突破性研究成果: （1） 平台仪器方面，我们成功搭建一套高时空分辨的细胞内三维单分子荧光跟踪观测平台，实现了细胞内单分子水平的横向27nm和轴向35nm高空间分辨，以及毫秒级的高时间分辨动态成像。（2）基于上述建立的实验平台，获得了多项重要科学进展：a）首次测定了单细胞内三维扩散，并发现了细胞内的准二维扩散特征；b）深入研究了细胞凋亡过程中的内部动力学特征，首次发现了凋亡早期的细胞内转运动力学加速现象，阐明其源于凋亡早期的ATP提高；c）首次发现了无膜细胞器“细胞蛇”的主动运输现象，并实验证实其为马达蛋白牵引下沿微丝的定向运动；d）研究了单个DNA分子的折叠动力学，发现了平行结构的G-三联体DNA，以及揭示了阳离子如何影响了G-四联体DNA的折叠结构及动力学。通过本面上项目资助，共发表了(共同)第一/通讯论文8篇，包括PNAS，CPL Express Letters, FASEB Journal, JPCB等国际先进期刊，并受到英国物理学会杂志Physics World，国家自然科学基金网站，中国科学院院刊(英文)等权威机构的报导。本项目所建立的实验方法，以及取得的系列研究成果，使我们能够在单分子单细胞水平更好的理解复杂生命过程的物理机制，而且提高了我国单分子单细胞研究在国际上的学术影响。

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