DP9柿子单宁对其靶标蛋白蛇毒PLA2的特异识别与共价修饰位点研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31271833
项目类别：
面上项目
资助金额：
80.0万
负责人：
李春美
依托单位：
华中农业大学
学科分类：
C2002.食品生物化学
结题年份：
2016
批准年份：
2012
项目状态：
已结题
起止时间：
2013-01-01 至2016-12-31

项目参与者：
刘茹；张久亮；邹波；张颖；董晓倩；杜静；卫乐红；钟莉；
关键词：
共价修饰特异识别靶标蛋白 PLA2 DP9柿子单宁

项目摘要

Carrying on a further research on the unique structure of persimmon tannin and the specific recognition mechanism of persimmon tannin on its target proteins may provide a novel pathway from the molecular level to explain its special pharmacological effects. In our previous studies we found for the first time that DP9 persimmon tannin had a special structure and was the most effective detoxifying component against snake venom both in vitro and in vivo, especially it had a special affinity on snake venom phospholipase A2 (PLA2) , and could modify its structure covalently, thus irreversibly changed the structure and function of PLA2. But the detailed recognition pathway and the specific covalent binding sites remain unclear. Based on the previous results and the first finding of covalent modification of PLA2 by DP9 persimmon tannin, this project will further study the specific recognition mode and detailed covalent binding sites of DP9 persimmon tannin on its target protein PLA2 by combining use of SPR, MALDI-TOF-MS, solid NMR, molecular modeling and other new technology. The successful completion of this project will help develop new strategies for understanding the special pharmaceutical activity of DP9 persimmon tannin, and will provide novel targets for developing anti-venom drugs, and will supply reference methods for studying the interaction of complex polyphenols with protein as well.

对柿子特征成分柿单宁个性特征及其与特定靶标蛋白质独特的识别机制与作用途径进行深入研究可为我们从分子水平阐释其特殊药理作用提供了一条新思路。我们在前期研究中首次发现具有特殊结构的DP9柿单宁体内外解蛇毒功效最为显著，特别是发现其对蛇毒蛋白中磷脂酶A2有特殊的亲合力，能通过共价作用不可逆改变其靶标蛇毒PLA2的结构和功能，但DP9柿子单宁对蛇毒PLA2特异性识别途径及共价作用位点尚不清楚。本项目将在前期实验结果及首次发现DP9柿子单宁能共价修饰蛇毒PLA2结构的基础上采用SPR、MALDI-TOF-MS、固态NMR、分子模拟及生物学信息等多种新技术结合继续和进一步深入研究DP9柿子单宁对其靶标蛇毒PLA2的特异性识别模式及具体的共价交联位点。项目的顺利完成将为阐述柿单宁特殊药学作用的分子机制提供新理论，为解蛇毒药物的研制提供新靶点，也将为研究复杂多酚类化合物与蛋白质的相互作用提供方法参考。

结项摘要

对柿子特征成分柿单宁及其与特定靶标蛋白质独特的识别作用机制进行深入研究可为我们从分子水平阐释其特殊药理作用提供了一条新思路。我们在前期研究中首次发现具有特殊结构的DP9柿单宁体内外解蛇毒功效最为显著，其对蛇毒蛋白中磷脂酶A2有特殊的亲合力，能通过共价作用不可逆改变其靶标蛇毒PLA2的结构和功能，但其识别途径及共价作用位点尚不清楚。本项目通过动物实验证实了DP9柿单宁特征结构单元A型EGCG和ECG二聚体对PLA2的催化活性及其所致的致死毒性、神经毒性、肌肉毒性、溶血活性、抗凝活性和致肿活性均有显著的抑制作用，是柿DP9单宁解蛇毒作用的关键结构单元。随后采用FT-IR，DSC，HPLC等多种手段研究了柿单宁特征结构单元对PLA2结构的影响，并结合SPR，ITC和SDS-PAGE/NBT staining等分析技术对两者相互作用模式进行了探索，最后通过分子对接，氨基酸修饰及LC-MS/MS等方法研究了柿单宁特征结构单元与PLA2的相互作用位点，深入探讨柿单宁解蛇毒机制。主要研究结果如下：DP柿单宁以及其特征结构单元对PLA2的催化活性及致死毒性、神经毒性、肌肉毒性、溶血活性、抗凝活性和致肿活性均有不同程度的抑制作用，其中A型EGCG二聚体和ECG二聚体是DP柿单宁解蛇毒作用的关键结构单元；DP9柿单宁对中华眼镜蛇PLA2催化活性及毒性抑制作用机制为：第一，柿单宁可通过与PLA2结合改变PLA2的二级结构，扰乱PLA2发挥活性及毒性的空间结构；第二，柿单宁结合于PLA2的活性疏水腔区，阻挡了底物小分子与活性中心的接触，并且干扰了钙离子结合环，从而抑制了PLA2的酶活，由于PLA2的部分毒性如溶血活性、肌肉毒性、致死毒性等依赖于其酶活性中心的完整性，因此该部分毒性也受到了抑制；第三，柿单宁通过共价修饰PLA2的某些对催化活性和毒性都至关重要的氨基酸残基，如组氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸，而起到解毒作用。