基于“MIPs宽覆盖提取”和“衍生化特征峰识别”的甾体激素分析方法及其在慢性肝炎机制研究中的应用

The abnormal metabolism of sex steroids was closely related to chronic hepatitis. The sub-metabolomic study of sex steroids will be helpful to reveal the mechanisms of the development and progression of chronic hepatitis. First, aimed at solving the problems of poor specificity and new compound identification, this project tries to establish a new method for profiling sex steroids from two aspects: the specific enrichment method, and post-acquisition data processing strategy. In terms of the specific enrichment method, the wide-coverage molecularly imprinted polymers (MIPs) are prepared by the semi-covalent method with multiple templates. The prepared MIPs will be used to enrich the nuclear structures of sex steroids with high specificity. In the matter of the data post-processing strategy, the extraction of characteristic peaks after dansyl chloride and Girard P derivatization is used to discover the mass spectrometric signal of sex steroids rapidly. Next, the new analytical method will be applied to the metabolomic study of chronic hepatitis. Key sex steroids and enzymes indicative of chronic hepatitis will be screened by metabolomics and be validated by pharmacological techniques, and the key metabolic pathway will be constructed. Then the correlation between the key metabolic pathway and NF-κB pathway will be discovered and validated by systems biology, online protein database, and pharmacological techniques. Finally, the regulatory mechanism of sex steroids on chronic hepatitis will be elucidated, and provide the theoretical basis for the study of clinical diagnosis and treatment.

甾体激素的异常代谢与慢性肝炎密切相关，其亚类代谢组学研究有助于揭示慢性肝炎发生和发展的机制。本课题针对甾体激素分析方法专属性差和新结构识别难的问题，拟分别从特异性分离富集方法和质谱数据后处理策略两个方面入手，建立甾体激素亚类代谢组学分析新方法。在特异性分离富集上，利用分子印迹聚合物(MIPs)的特点，采用半共价键法，以多个特征甾体激素为模板，制备对甾体激素母核具有特异性识别的宽覆盖MIPs；在质谱数据后处理上，利用丹磺酰氯和吉拉德P衍生化后特征峰的提取快速识别甾体激素。将新建立的分析方法运用于慢性肝炎的代谢组学研究，筛选出反映慢性肝炎发生发展的关键甾体激素，采用药理学技术手段验证关键代谢酶，并构建关键代谢通路网络。进而通过系统生物学、蛋白数据库以及药理学等相关技术发现并验证关键代谢通路网络与NF-κB通路之间的相关性，阐明甾体激素对慢性肝炎的调节机制，并为临床诊断和治疗研究提供理论基础。

本项目获国家自然科学基金（NO. 81803484）资助。内源性甾体激素参与多种生理活动，其代谢异常与多种疾病高度相关，然而其在人体内浓度低、受基质干扰大，难以准确检测。本研究制备了一种高选择性、宽覆盖提取痕量甾体激素的磁性分子印迹聚合物，建立了甾体激素类化合物高效富集方法和检测方法，为临床甾体激素相关疾病的研究提供稳定的技术路线。通过项目组得共同努力，成功合成了介孔二氧化硅纳米磁珠、磁性载体四氧化三铁修饰的双模板分子印迹聚合物和三模板分子印迹聚合物。三模板分子印迹聚合物对水溶液中的雌酮、雌二醇、雌三醇、PROG、孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮六种甾体激素六种雌激素的吸附结果最佳，吸附回收率在68%-94%。透射电子显微镜和磁滞回线表明合成的三模板分子印迹聚合物颗粒均匀，尺寸在300 nm左右，具备超顺磁性。三模板分子印迹聚合物的FT-IR、比表面积和孔径分布测试结果，在1729 cm-1处有酯基伸缩振动峰，比表面积和孔径大小分别为557.29 m2/g和14.18nm；吸附剂的量为30 mg，吸附时间为30 min，溶剂为50%甲醇-水，洗脱20 min时达到最佳吸附条件，模板分析物的回收率均在80%以上，吸附剂重复使用三次后回收率保持在75%以上。三模板分子印迹聚合物可特异性吸附E1、E2、E3、PROG、PREG、17-OHPROG、6-酮雌酮、4-羟基雌酮、16-羟基雌酮、去氢表雄酮、4-甲氧基雌酮、雌二醇-苯甲酸酯、7-去氢雌二醇、2-羟基雌二醇、16-表雌三醇、2-甲氧基雌二醇、雌二醇17-丙酸酯、雌二醇17-庚酸盐、雌二醇17-戊酸和炔雌醇等20种甾体激素。将三模板分子印迹聚合物应用于人血清样本中的甾体激素的测定，最低定量限（LLOQ）为10-20 pg/mL，分析物线性关系良好，提取回收率在85%-114%，除雌二醇17-庚酸盐、雌二醇17-戊酸、炔雌醇三种激素未被检测，其他17种甾体激素可成功定量。课题实施已达预期目标，已发表高质量研究论文3篇，成功制备得表面聚合多模板印迹聚合物具备宽覆盖、高效、特异性提取甾体激素特点，吸附剂质量均一、吸附结果稳定。

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