基因组挖掘发现生防菌短短芽孢杆菌X23中的新型天然产物

Microbial natural product are the major resources of pharmaceuticals and agricultural medicine. Recently, genome mining of the natural product from microorganism genome information has become new tendency in novel nature product discovery, which employs bio-information tools to predict the biosynthetic potential of producer strains, guiding purification and structure elucidation of novel compounds, and has been successfully applied in natural product discovery in both bacterial and fungal. Brevibacillus brevis X23, an excellent endotrophic antagonistic bacterium isolated from the stem of tobacco, exhibited broad antimicrobial spectrum and high control efficiency to tobacco bacterial wilt in the field test. The genome sequence of Brevibacillus brevis X23 has been finished, indicated 12 antibiotics and secondary metabolites gene clusters exist in the genome, from which two complete NRPS/PKS gene clusters exhibited low similarity to the known gene cluster, and also the predicted chemical structure biosynthesis by these gene clusters exhibit high difference and novelty to the known chemical. In this project, we will employ the approaches of gene knock-out, homologous expression and heterologous expression to discover the function and the structure of the chemical which biosynthesis by these two orphan gene clusters, which may discover novel antimicrobial peptides from Brevibacillus brevis X23, and will provide a helpful method to discover natural product for other antagonistic Bacillus.spp.

微生物天然产物是重要的医用和农用药物资源，利用微生物基因组信息预测其产生特定天然产物的潜能，进而发现新化合物的基因组挖掘技术（Genome Mining）已经成为国内外研究的热点，并在多种新型微生物天然产物的发现中得到成功应用。短短芽孢杆菌X23是我们从烟草中分离到的广谱内生拮抗细菌，对烟草青枯病的平均防治效果达85%以上。短短芽孢杆菌X23已经完成基因组测序，生物信息学分析发现其基因组中含有12个次生代谢产物生物合成基因簇，其中有2个模块完整的非核糖体肽(NPRs）和多聚酮（PKs）生物合成基因簇与他基因簇同源性不高，且预测的化合物结构未见报道。本研究将采用基因敲除、沉默激活或异源表达的方法，结合化合物的分离纯化和结构鉴定，探明这两个孤儿基因簇合成的天然产物种类及结构，期望从中找出结构新颖、活性突出的新型抗菌天然产物，为新药物的开发提供更多资源，为其他生防芽孢杆菌的研究提供参考和借鉴。

微生物天然产物是重要的医用和农用药物资源，利用微生物基因组信息预测其产生特定天然产物的潜能，进而发现新化合物的基因组挖掘技术（Genome Mining）已经成为国内外研究的热点，并在多种新型微生物天然产物的发现中得到成功应用。短短芽胞杆菌（Brevibacillus brevis）X23是我们分离到的广谱拮抗细菌，作为茄科作物青枯病生防菌已经大面积应用。为了深入研究其作用机制，挖掘其产生的新型次生代谢产物及其植病生防上的作用，本研究采用三代测序技术重新绘制了准确的生防菌B. brevis X23全基因组完成图，通过生物信息学分析预测了其中可能的次数代谢产物生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster,BGC）；建立起了一套简单快捷的基于Red/ET重组的芽孢杆菌次生代谢产物产物BGC的直接克隆和异源表达的技术体系，并直接克隆出生防菌B. brevis X23菌株中02#、09#2个NPRS/PKS孤儿基因簇，并在枯草芽孢杆菌中尝试进行了异源表达；本项目还建立起了基于温敏型载体和Cre-loxP技术的生防菌B. brevis X23菌株中无标记基因敲除（Markerless Gene Konckout）和激活体系，并通过对02#、04#、09#三个次生代谢产物生物合成基因簇的敲除、原位激活（启动子更换），确定了09#基因簇负责合成的次生代谢产物是生防菌X23产生的最主要的抗菌物质，该化合物对革兰氏阳性、阴性细菌和真菌具有广谱抑菌活性，通过分离纯化和结构鉴定证明09#基因簇合成的化合物为非核糖体肽类化合物Edeines，化合物结构中含有多个稀有氨基酸，其中的新颖氨基酸DAHAA在其他化合物中未见报道；通过对该化合物基因簇进行生物信息学分析和基因敲除，本项目初步推测了生防菌B. brevis X23中抗菌主效因—非核糖体肽Edeines的生物合成途径。本项目的实施及建立的技术方法，为生防菌B. brevis X23以及其他B. brevis 的深入研究突破了技术瓶颈，也为研究和挖掘生防芽孢杆菌中的新型次生代谢产物提供了新的技术方法。本项目已发表SCI论文2篇，中文期刊2篇。

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