除虫菊CHS合成酶及其互作蛋白协同调控除虫菊酯合成代谢的催化机制解析

Pyrethrum (Tanacetum cinerariifolium) is an ornamental plant of Composite family, and is well-known for its natural insecticide pyrethrins. Chrysanthemol synthase (CHS) is the first key enzyme involved in the biosynthesis of pyrethrins which performed both prenyltransferase and terpene synthase activity. However, CHS shows low enzyme activity in vitro while with high activities in the plants. In a previous study, we isolated a high homologous gene named FAS which shared the same expression pattern and subcellular localization with CHS and we found product amount of CHS highly increased with the help of FAS in vitro and in vivo. GGDS was also reported to participate in the catalytic progress of monoterpene synthases as its molecular chaperone. So, we speculated that the enzyme activity of CHS maybe improved by binding with other proteins such as FAS or GGDS to form heterodimers in plant. Thus, to clarify the catalytic mechanism of CHS and the function of FAS and GGDS in plant, we try to carry out the enzyme activity detection with different enzyme combinations in vivo and analyze gene expression of CHS and its protein partner in overexpressed and knocked-down transgenic plants. This study would not only clearly identify the catalytic mechanism of irregular monoterpene synthases, but also be very helpful for the content increase of natural pyrethrins and insect-resistance improvement of other crops.

除虫菊为菊科观赏花卉，以含天然杀虫剂除虫菊酯著称。菊基醇合成酶（CHS）是除虫菊酯合成代谢的首个关键酶基因，其同时具备萜类转移酶和单萜合成酶的双重活性。然而，CHS在体外几乎不具备催化活性，却能在植物体内高效行使双重催化功能。我们前期初步证实，除虫菊的FAS蛋白（与CHS高度相似）可在体内外显著提高CHS催化活性。结合前人报道GGDS蛋白也可作为分子伴侣参与单萜合成酶的催化过程，我们推测CHS在植物体内可能存在结合FAS或GGDS互作蛋白来提高催化活性的机制。本项目拟通过CHS互作蛋白鉴定、不同酶组合体外反应、超表达与沉默植株中CHS及其互作蛋白酶动力学检测以及代谢产物分析，阐明CHS合成酶的底物催化特性，明确FAS和GGDS互作蛋白的功能，解析CHS及其互作蛋白调控除虫菊酯合成代谢的催化机制。本项目对揭示植物单萜合成酶催化机理、提高除虫菊酯含量和作物抗虫性具有重要的理论和环保产业意义。

除虫菊（Tanacetum cinerariifolium,syn.Chrysanthemum cinerariifolium）为菊科多年生草本植物，兼具观赏植物和经济作物多重用途，尤其以产生安全无毒，环境友好的天然杀虫剂除虫菊酯而著称，CHS是除虫菊酯合成路径中的首个关键前体合成酶。项目前期研究发现，CHS在体外几乎不具备催化活性，而在植物体内却能高效催化除虫菊酯前体产物菊基醇的合成。因此，我们推测在植物体内存在有能正向辅助CHS合成酶的调控因子。本项目通过互作蛋白鉴定、酶体内外产物测定、转录因子功能分析等手段筛选并证实了除虫菊体内调控CHS合成酶参与除虫菊酯代谢的相关蛋白因子。首先，克隆得到FAS基因，与CHS基因具有较高的氨基酸相似性以及在除虫菊中相同的基因表达模式，且同样定位于质体。FAS与CHS不具备直接蛋白互作，但可通过诱导CHS产物CPP的加速水解从而促进CHS合成酶最终产物合成。同时，FAS在植物体内外能催化DMAPP和IPP产生法尼醇FOH，因此具有异戊烯基转移酶和萜类合成酶的双重蛋白酶活性。其次，我们克隆了烟草NiGGDS基因以及除虫菊TcGGDS基因，双分子荧光杂交试验证实GGDS与CHS具备直接蛋白互作关系。进一步对CHS和GGDS不同的纯化蛋白酶组合进行体外酶活性反应以及对GGDS瞬时转化除虫菊植株代谢产物测定证实，GGDS蛋白能作为CHS的辅助蛋白因子提高CHS的催化活性。最后，我们结合转录组学分析，鉴定到一个茉莉酸信号分子MYC2，可通过直接结合CHS合成酶基因以及另外两个除虫菊酯合成酶基因AOC和GLIP的启动子E-box/G-box顺式元件诱导基因表达。在除虫菊叶片中分别进行瞬时MYC2超表达与干涉进一步证实其能正向调控CHS合成酶基因从而促进除虫菊酯代谢合成。该研究对揭示植物单萜合成酶催化机理，利用分子手段提高除虫菊酯含量具有重要的理论和产业意义。

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