天蓝色链霉菌丙酰辅酶A羧化酶的功能改造及应用

Propionyl-CoA carboxylase（PCC）is the key enzyme in biological carbon dioxide fixation, polyketide products biosynthesis and odd-chain fatty acids β-oxidation, however the application of PCC was limited by its low activity. Although the crystal structure of PCC had been revealed, its function reformation is difficult to conduct effectively. In our previous study, PCC from Streptomyces coelicolor A3(2) was proved to have a higher enzyme activity and its substrate recognition subunit carboxyl transferase (CT) will be researched in this project. CT will be engineered by directed evolution and rational design to improve their enzymatic activity, and oxaloacetate auxotrophy-dependent genetic selection system will be constructed to enrich the active variants. Three-dimensional structure of CT mutation will be developed by homology modeling method, the substrate binding site and active site will be analyzed and the interaction mechanism of mutant site-structure-function will be elucidated. CT derivatives with higher enzyme activity will be used to construct a recombinant strain for succinate production, and the succinate yield will be tested by fermentation. This study will firstly provide the technical basis for function reformation of PCC, enrich scientific information about the carboxylase catalytic mechanism, and will also promote the development of CO2 biotransformation industry.

丙酰辅酶A羧化酶(PCC)是二氧化碳生物固定途径的关键酶，在聚酮类物质合成、脂肪酸代谢等方面也发挥重要作用，但其催化活性较低，应用受到严重限制；已有研究虽然获得了PCC的三维结构信息，针对该酶的功能改造研究一直比较缺乏。前期研究发现来自Streptomyces coelicolor A3(2)的PCC酶活较高，本研究将以该酶的底物识别亚基羧基转移酶(CT)为研究对象，构建基于草酰乙酸营养缺陷型的遗传选择系统用于PCC高通量筛选，结合定向进化与理性设计方法获得高活性的CT突变体；利用同源建模方法，解析突变氨基酸位点-结构-功能的相互影响机制；将得到的高活性CT突变体应用于琥珀酸工程菌株的构建，提高琥珀酸产量。本研究将建立PCC功能改造研究的技术基础，丰富羧化酶催化机理认知，促进CO2生物转化产业的快速发展。

丙酰辅酶A羧化酶是一类广泛存在的生物素依赖酶，在生物利用CO2、天然产物合成等领域具有广阔的应用前景。丙酰辅酶A羧化酶由三个亚基组成，羧基转移酶亚基是其识别不同底物发挥催化作用的关键亚基，该亚基催化活性低是阻碍丙酰辅酶A羧化酶应用的关键因素。为了获得高催化活性的丙酰辅酶A羧化酶，在重组大肠杆菌中表达了七种不同来源的丙酰辅酶A羧化酶的羧基转移酶亚基，其中枯草芽孢杆菌来源的羧基转移酶表现出最高的催化能力。为了进一步利用定向进化手段优化该蛋白，设计了一个基于草酰乙酸营养缺陷的基因筛选系统，将丙酰CoA羧化酶的催化能力与宿主菌在基础培养基中的生长状况进行关联。经过突变文库的筛选，四种氨基酸突变体D46G、L97Q、N220I和I391T对酶催化活性的提升有较大帮助，经过单突变体的随机组合及筛选，最终发现 组合突变体N220I/I391T 的催化活性提高至野生型的5.6倍，kcat/Km值提高了94倍。随后我们将优化后的丙酰CoA羧化酶应用于二氧化碳的生物固定，通过在大肠杆菌中异源构建3-羟基丙酸循环部分途径来建立新型琥珀酸生物合成途径，并利用同位素标记实验进行了证实。进一步通过工程菌质粒拷贝数优化、菌体代谢负担优化、阻断中间产物的消耗等代谢工程手段，对工程菌株的生产能力进行优化，琥珀酸的生产较原始出发菌株增长2.56倍。与传统工程菌利用PEP或丙酮酸羧化制备琥珀酸相比，该新途径无需厌氧环境且二氧化碳固定效率更高，一分子琥珀酸的生成伴随两分子二氧化碳的固定，为二氧化碳更广泛的生物利用及琥珀酸的发酵生产奠定了基础。

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