cAMP-epac-rap1信号通路在热激诱导家蚕非减数分裂孤雌生殖发生中的作用和机制研究

Cytological studies have shown that the ameiotic parthenogenesis of silkworm is attribute to the destruction of the spindle in the first stage of meiosis, which causes the homologous chromosomes to be separated early and form unreduced pronuclei. It is critical to clarify the heat shock-induced ameiotic parthenogenesis of silkworm by which the heat shock signal regulates the formation of spindle. We have previously screened the cAMP-Epac-Rap1 pathway for specific activation in parthenogenetic lines following heat shock induction by transcriptome comparison analysis. Studies have shown that this signaling pathway can regulate the process of meiotic spindle formation. This study is to detect the expression of the key molecules and their activation sites by phosphorylation proteome, and then verify the response of cAMP-Epac-Rap1 in parthenogenetic heat stimulation. The down signal factors of Rac1 will be further screened, and their regulation relationship be studied. This study can preliminary reveal the role of cAMP-Epac-Rap1 signaling pathway in ameiotic parthenogenesis in silkworm. The results will provide important information for the study of the molecular mechanism of parthenogenesis in silkworm.

细胞学研究显示家蚕非减数分裂孤雌生殖的发生是减数分裂第一次成熟分裂中期的纺锤体被破坏，从而使同源染色体早期分离，形成未减数的原核。热激信号通过哪些信号通路调控纺锤体形成受阻是阐明热激诱导家蚕非减数分裂孤雌生殖发生的关键。我们前期通过转录组比较分析筛选到cAMP-Epac-Rap1通路在热激诱导后的孤雌生殖系中特异激活，已有研究表明该信号通路能调控减数分裂纺锤体形成过程。本研究拟通过信号分子的表达变化验证，定量磷酸化蛋白质组筛选信号通路关键分子的活化位点，明确cAMP-Epac-Rap1的响应，通过信号通路的抑制和活化验证其在孤雌生殖热激诱导中的作用，并进一步筛选信号通路关键因子Rac1的下游作用因子，分析相互间的调控关系，本研究能初步揭示cAMP-Epac-Rap1信号通路在家蚕非减数分裂孤雌生殖发生中的作用机制，为解析家蚕孤雌生殖发生分子机制提供新的理论知识。

为了研究cAMP-Epac-Rap1信号通路在热激诱导家蚕孤雌生殖发生中的作用，对家蚕孤雌生殖系和两性生殖系两种生殖模式的家蚕未受精卵进行cAMP信号通路转录谱比较分析，进一步对信号通路中的关键基因进行qRT-PCR验证，结果显示在孤雌生殖系无9中AC、Rap1、Tiam1、Vav2和Rac1的表达显著高于两性生殖系丰一。用酶联免疫分析法（ELISA）检测孤雌生殖系和两性生殖系未受精卵热激诱导前后的cAMP含量和AC、Rap1、Rac1、PAK的含量及活性，发现AC、Rap1、Rac1、PAK的含量及活性在孤雌生殖系中均明显高于两性生殖系，而cAMP含量在两性生殖系丰一中略高于孤雌生殖无9，推测这可能与PDE的调节有关。利用 iTRAQ 定量磷酸化蛋白质组学技术比较孤雌生殖系和两性生殖系未受精卵热激诱导前后磷酸化蛋白表达谱，共鉴定到17个cAMP信号通路相关蛋白被磷酸化修饰，其中在Epac-rap1信号通路下游有5个被磷酸化修饰的蛋白: MEK、ERK1/2、B-Raf, AF6 and PAK1, 共鉴定到6个差异表达位点，其中MEK最多，有3个差异表达位点。这些蛋白在两个品系中磷酸化修饰水平存在差异可能与热激诱导孤雌生殖过程的调控有关。进一步的酶活抑制实验暗示cAMP-PKA和cAMP-Epac通路可能共同调控于热激诱导家蚕孤雌生殖发生过程，但是存在效应差异。为了进一步鉴定热激诱导家蚕孤雌生殖发生的分子基础和分析cAMP信号通路关键因子在蛋白水平的表达，通过iTRAQ定量蛋白组比较孤雌生殖系和两性生殖系热激诱导前后表达谱差异, 在热激诱导前的表达谱中鉴定到7个cAMP信号通路相关蛋白，其中3个蛋白在孤雌生殖系和两性生殖间存在丰度差异，包括丰度减少的PAK、ras-like protein 2蛋白和丰度增加的PI3K蛋白。热激诱导后共鉴定到5个蛋白，其中只有PPI在孤雌生殖系中丰度增加，其余4个蛋白包括Rap1、Rac1和PAK在孤雌生殖系和两性生殖系间没有显著的丰度差异。 Rap1和Rac1 在转录水平、蛋白水平和酶活性水平上的差异，推测可能存在转录后调控与翻译后调控。本研究结果初步揭示了cAMP-Epac-Rap1信号通路在热激诱导家蚕孤雌生殖发生中的响应和可能作用, 为进一步探索复杂的家蚕孤雌生殖诱导发生机制提供信号通路方面的信息。

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