利用CRISPR技术建立条件性PBRM1/BAP1双基因敲除小鼠肾癌疾病模型

VHL, PBRM1, and BAP1 are closely associated with ccRCC (clear cell renal cell carcinoma) tumorigenesis. Patients with both PBRM1 and BAP1 mutations show shorter survival, high tumor grade, high risk of metastasis and the worst outcomes. The molecular mechanism of this double-mutant tumor is still uncovered. Recently, we generated genetically engineered mouse models (GEMM) for ccRCC including VHL-BAP1- and VHL-PBRM1-deficient mice. Both VHL-BAP1- and VHL-PBRM1-deficient kidneys recapitulate the morphology and biological behavior of human ccRCC. In this study, GEMM by CRISPR will be established to develop tumorigenesis in VHL-PBRM1-BAP1 deficient mice kidneys. To identify PBRM1-BAP1-associated target protein, mass spectrometry and sequencing analysis will be conducted. In addition, clinical therapy studies will be performed using this GEMM model and tumor cell lines derived from mice tumors. This project is critical to elucidate the mechanism by which PBRM1-BAP1 inhibits ccRCC tumorigenesis and to accelerate cancer therapy development for kidney cancer.

VHL、PBRM1、BAP1是与肾癌发生密切相关的三个抑癌基因，携带PBRM1与BAP1双基因突变的肾癌病人，生存时间短、恶性程度高、转移风险大、预后差，其发病机制尚不清楚。我们在前期工作中，建立了VHL-BAP1、VHL-PBRM1基因敲除小鼠肾癌模型，这两个小鼠模型具有典型的肾透明细胞癌病理学特征，具有临床学价值。为进一步研究PBRM1-BAP1双基因突变肾癌的发病机制，探索治疗手段，迫切需要建立基因敲除小鼠模型。因此，本项目在前期工作的基础上拟开展以下工作：1.CRISPR技术制作PBRM1-BAP1敲除小鼠，建立VHL-PBRM1-BAP1敲除小鼠肾癌模型；2.蛋白质谱、测序等鉴定与PBRM1-BAP1相关的靶蛋白；3.利用小鼠肿瘤模型及其肿瘤细胞系评估临床药物的治疗效果。本项目对于研究PBRM1-BAP1双基因突变的肾癌发病机制、药物筛选、探索新的治疗手段具有重要科学意义。

PBRM1/BAP1双突变的肾癌患者恶性程度高，存活时间短，关于PBRM1/BAP1双突变肾癌亚型的基础与临床研究鲜有报道。因此，本研究我们侧重于PBRM1/BAP1双突变的肾癌亚型，通过Cre/Loxp系统建立PBRM1/BAP1双突变的肾癌小鼠模型，通过动物模型，模拟肿瘤发生、研究PBRM1/BAP1同时缺失对动物生理、病理的影响。① 我们成功制作了PBRM1/BAP1双敲除的flox小鼠，PCR、Western等鉴定结果表明，转基因小鼠制作正确，Cre/Loxp系统正确工作；② PBRM1/BAP1缺失后，对细胞增殖的影响，通过细胞增殖曲线以及CCK8等实验表明，与野生型MEF细胞相比，PBRM1/BAP1缺失的MEF细胞，增殖速度有所减慢；③ PBRM1/BAP1缺失导致小鼠出现多囊肾、肾脏发育混乱、肾脏导管异常变大、肾脏有积液、肾衰等表型。④ VHL/PBRM1/BAP1敲除小鼠肾脏出现多囊肾、结节、非典型增生、部分病灶形成实体瘤；小鼠自发形成的肿瘤病灶，恶性程度高，发现染色体畸形等形态，部分病灶细胞清澈透明类似于典型的人肾透明细胞癌病理学特征；⑤ VHL/PBRM1/BAP1敲除小鼠肾肿瘤分子病理特征：小鼠肾脏结节中细胞增殖活跃Ki67 阳性，肾透明细胞癌标志物CAIX强阳性表达，mTOR信号通路阳性表达，Vimentin阳性、CD10阳性、PAX8阳性，定量qPCR检测表明HIF 信号通路激活，这些分子病理学特征与肾透明细胞癌相似。⑥与以前的研究结果相似，只有VHL与PBRM1/BAP1协同纯合子缺失才能导致肾肿瘤发生，通过动物证明了VHL、PBRM1、BAP1在肾癌中是双打击基因。⑦通过蛋白质谱分析，比较VHL/PBRM1/BAP1敲除小鼠与野生型小鼠肾脏的差异蛋白。1）差异蛋白涉及以下几个大类：钙离子通道、质膜蛋白、细胞结构组成相关蛋白、细胞核相关蛋白、细胞外基质（分泌）蛋白、细胞迁移等相关蛋白。2）差异蛋白涉及的信号通路：细胞合成、脂代谢、氨基酸代谢、器官形成、DNA修复损伤、免疫、细胞膜转运、细胞有丝分裂等。因此，PBRM1/BAP1基因敲除小鼠肾癌疾病模型的建立为肾癌的临床与基础研究提供可靠的动物模型，为全面阐明PBRM1/BAP1双突变肾癌的发病机制、开发有效的药物、探索正确的治疗手段等方面提供理论依据，积累更多更新的资料。

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