基于糖识别作用的细胞因子生物锚定技术及其在骨修复中的潜在应用研究

Biomaterials for bone repair are lack of biofunctions that can actively mediate the cells behavior, therefore lead to a poor bone regeneration speed. Immobilization of cytokines onto the interface of biomaterials appears to be an effective approach for inducing osteogeneration. Recently a genetic engineering approach is developed to fuse functional groups onto cytokine structure. The groups contain specific binding ability towards the substrates, therefore can serve as an anchor to fix cytokines mildly while tightly. However, its application is limited by the tedious process and high cost. Based on our knowledge on lectin-sugar interaction and the glycan structures that widely exist on many cytokine surfaces, we propose a novel approach to anchor cytokine through Con A-sugar interaction. Using PLGA as the model substrate, we investigate the possibility of anchoring three varieties of cytokines with sugar chains i.e. FN, rhBMP-2(CHO expressed) and rhVEGF165 (CHO expressed) onto Con A grafted PLGA surface for inducing bone regeneration. The anchoring capacities of the Con A grafted surface, and the stability and bioactivies of the anchored cytokines are estimated. And co-anchoring multiple cytokines via Con A site is also evaluated. The biofunctions of cytokine single anchored and co-anchored PLGA surface are testified through in vitro and invo experiment. We anticipate to build up a sugar-recognition based cytokine anchoring or co-anchoring approach that could keep cytokine active long-lastingly, therefore can improve the osteogeneration and vascularization for bone repair. Our study will bring in an innovative thought toward bioactive surface functionalization of materials. It will also broaden the application field of Con A as functional materials.

骨科植入材料因缺乏主动调节细胞响应的生物功能，骨再生速度慢。在材料表面固定细胞因子诱导骨再生，是可行方案。利用基因技术在细胞因子结构中融合特定基团，借助基团与材料基体的键合，细胞因子可被温和固定并长效发挥功能。但该技术繁琐，成本过高。本项目借鉴该技术思路，关注细胞因子固有糖链结构，提出利用刀豆球蛋白Con A对糖链的生物特异性结合，以固定细胞因子的生物锚定技术。以聚酯PLGA为模型基底，研究Con A修饰的材料对骨再生涉及的三种糖基化细胞因子FN、rhBMP-2和rhVEGF165进行生物锚定的可行性。考察锚定效率、锚定因子的稳定性及生物活性。进一步研究Con A对多因子共锚定技术。借助体内外生物实验考察单/多因子锚定表面的生物功能及其协同促进成骨和血管化的功能。通过优化实验参数，期望建立一种能长效协同促进骨再生的材料表面功能化方案。同时还将拓宽Con A在生物材料领域的应用范围。

构建具有生物学特性的材料基质对开发适用于临床的活性生物材料非常重要。但是利用位点特异性策略活性固定生长因子一直是一个重大挑战。考虑到糖基化广泛存在于哺乳动物蛋白或重组蛋白中，我们建立了基于生物亲和力的蛋白质固定策略（生物锚定法）。这种策略利用伴刀豆球蛋白A（Con A）和携带有寡糖链结构的细胞因子之间的糖-凝集素相互作用，实现了将因子固定在材料界面的特定位点上，同时保留其生物活性。我们首先利用MALDI-TOF-MS、QCM、图案化抗污凝胶三种手段证明了由293T细胞表达的重组细胞因子携带了高甘露糖型糖链，同时这种糖链结构介导了细胞因子与Con A的特异性识别和结合。在此基础上，我们建立了材料界面Con A化修饰的通用方法，利用Con A直接锚定了细胞因子GBMP-2。 体外细胞水平上证实被生物锚定的细胞因子可显著促进细胞成骨分化，其活性与溶解的自由细胞因子能力相当，而前者使用的因子数量更少。而且这种固定策略确保了细胞因子能被长久保留，因此材料可以重复刺激多批次的细胞分化。即使在4°C的PBS中储存4个月后，被锚定GBMP-2仍保留持续刺激细胞分化的活性。最后，我们通过异位骨化实验证明了生物锚定GBMP-2在体内仍具有促进成骨的生物活性，而化学固定的GBMP-2几乎没有活性。此外，我们还探索了双因子GBMP-2/NGF担载模式对成骨的促进，动物实验表明，担载10 ug GBMP-2和7ug NGF组别产生了大量连续的骨小梁结构，且骨小梁密度最大。因此我们初步认为NGF和BMP-2协同使用能促进骨的形成。总体而言，我们的结果表明，利用糖识别作用固定蛋白质的策略是一种简单且通用的生物材料活性化手段。这种策略可确保活性组分被长久稳定地保留，因此对于活性材料的存储和体内应用具有重要意义。此外该策略有望应用于其他糖基化大分子的固定，可以为生物活性材料的开发提供更多机会。

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