ACVRL1：一个新的先天性肺静脉异位引流候选基因的识别及鉴定

As a very rare type of Congenital Heart Defects, the genetic mechanism of Total Anomalous Pulmonary Venous Return (TAPVR) remains unknown. In previous study, we identified a novel non-synonymous mutation (R218W) located at ACVRL1 gene in TAPVR patients by using Exome sequencing. This mutation is thought to be the most deleterious in silico analysis such as SIFT and PolyPhen2. ACVRL1 is a type I cell-surface receptor for the TGF-beta superfamily of ligands and high expresses in highly vascularized tissues such as lung and placenta. Here we propose the hypothesis that the ACVRL1 gene is a potential new pathogenic gene of TAPVR. To verify this hypothesis, we will carried out the following studies including further sequencing the ACVRL1 gene in in Chinese population, comparing the different expression of ACVRL1 gene in TAPVR and normal people and applying transgenic zebrafish experiments. The Sequenom platform experiment, Real time PCR, Western blot, Dual-Luciferase Reporter Assay System and the CRISPR / cas9 technology will be used. This study will elucidate the pathogenesis of TAPVR, and provide new clues for pulmonary vein abnormal development of birth defects.

完全性肺静脉异位引流（TAPVR）是一类罕见而又严重的先天性心脏病，严重威胁婴幼儿的生命，但至今为止对其发病机制仍知之甚少。前期我们利用外显子组测序技术在多名TAPVR患儿中发现了ACVRL1基因新发杂合突变R218W，软件分析该突变严重影响了蛋白功能。ACVRL1基因属于TGF-β信号通路，主要调节血管内皮细胞的增殖和胚胎发育。为此，我们提出假设：ACVRL1基因可能是TAPVR潜在的新的致病基因。为验证这一假说，我们将通过扩大样本验证、比较ACVRL1基因在患儿及正常人表达差异、模式动物斑马鱼实验，采用Sequenom平台分型实验、Real-time PCR、Western Blot、双荧光素酶报告基因和CRISPR/Cas9基因编辑技术等手段，从临床、细胞和模式动物等多方面探讨ACVRL1基因突变在肺静脉异位引流发生中的作用。本研究将为阐明肺静脉发育异常等疾病发生机制提供新的线索。

完全性肺静脉异位引流（TAPVC）是一类罕见而又严重的先心病，目前发病机制仍未清楚，尽管近年来有研究发现一些基因与TAPVC 相关，但缺乏可重复性。课题组前期对多个TAPVC 患儿进行家系外显子组测序研究发现ACVRL1基因新发突变（c.C652T / p.R218W），在父母及正常对照组中均未发现该突变，软件预测该突变明显损害了蛋白功能，STRING基因富集分析提示ACVRL1基因与SMAD9/SMAD1/GATA4等心脏发育因子关联。ACVRL1基因R218W突变的体外功能学研究：利用人肾上皮来源的293T细胞，构建转染野生型及p.R218W突变型载体。Western Blot显示R218W突变体影响了该基因蛋白质表达，突变型的蛋白表达量明显比野生型载体的蛋白表达量少，抑制ACVRL1的蛋白表达。免疫荧光实验显示ACVRL1基因的R218W突变型载体不影响其蛋白定位，与野生型均定位在细胞膜上。双荧光素酶报告基因实验结果显示ACVRL1基因R218W突变型显著抑制了启动子BMP9对ACVRL1基因正常的转录调控作用，下调了该基因的转录活性。利用斑马鱼模式动物进行了ACVRL1基因突变的斑马鱼体内功能试验： 成功构建ACVRL1野生型、R218W突变型载体和相应的斑马鱼模型；斑马鱼胚胎形态学观察及心率分析发现R218W突变型斑马鱼出现心包水肿与心率下降；转录组高通量测序数据分析中，基因功能注释提示ACVRL1基因对细胞发生分化、心脑发育、核糖体组成、转录因子结合等生物过程有影响，表达量分析显示R218W突变型斑马鱼胚胎中ATP2A2、MEF2A等心脏发育相关的重要基因表达明显下降；启动子预测软件显示ATP2A2、MEF2A等可与转录因子SMAD5 结合，而SMAD5是ALK1通路的下游底物，提示ACVRL1基因突变可能通过影响SMAD5调控ATP2A2、MEF2A等心脏发育相关基因来影响心脏发育。本研究为阐明TAPVC的发病机制提供新的线索和理论依据，对筛查肺静脉发育异常等出生缺陷有重要意义，同时将有可能为心脏相关疾病的诊断、治疗和研发新的药物提供新的靶点。课题组后期将进行小鼠模型研究，并继续扩大TAPVC人群进行验证。

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