GAPDH转录后调控钠通道SCN1A基因在Dravet综合征中的作用及机制研究

Voltage-gated sodium channel α1 subunit gene (SCN1A) is associated with epilepsy. The abnormal expression level of SCN1A leads to Dravet Syndrome (DS). Decreased sodium current densities in inhibitory interneurons leads to network hyperexcitability and seizures. Glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) is a multifunctional protein. As an RNA binding protein, GAPDH regulates gene expression at the post-transcriptional level by binding to the 3 'untranslated region (3′UTR). Our previous vitro study indicates that the mutation (c.*20A>G, c.*1794C > T) in SCN1A 3′UTR from DS patient increases the affinity of GAPDH binding to the SCN1A 3′UTR and decreases the reporter gene expression by affecting the mRNA stability. These findings suggest that the post-transcriptional regulation of SCN1A expression by GAPDH may be associated with DS. This study will further using the RNA-binding protein Immunoprecipitation (RIP) and RNA interference (RNAi) technology to analysis the post-transcriptional regulation of GAPDH to SCN1A and applying the patch-clamp technique to explore SCN1A 3 'untranslated region mutations influence to sodium channel electrophysiological characteristics. This study will help to reveal the post-transcriptional regulation mechanism of SCN1A by GAPDH in DS.

钠通道SCN1A基因与癫痫密切相关，其表达水平异常导致Dravet综合征（DS），抑制性中间神经元上的钠电流密度减少是其癫痫放电的基础。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种多功能蛋白，作为RNA结合蛋白，与基因3端非翻译区（3’UTR）结合，在转录后水平调控多种基因表达。本研究前期体外实验发现DS相关钠通道SCN1A基因3’UTR突变（c.*20A>G, c.*1794C>T）增强RNA结合蛋白GAPDH与SCN1A基因3’UTR结合，影响报告基因mRNA稳定性，在转录后水平下调报告基因表达，提示GAPDH转录后调控SCN1A基因可能与DS有关。本研究将进一步采用RIP、RNAi、mRNA稳定性检测技术来分析GAPDH对SCN1A基因转录后调控，同时应用膜片钳技术探讨SCN1A基因3’UTR突变对钠通道电生理特征的影响，以期揭示GAPDH转录后调控SCN1A基因在DS中的作用。

钠通道SCN1A 基因与癫痫密切相关，其表达水平异常导致Dravet 综合征（DS）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种多功能蛋白，作为RNA 结合蛋白，与基因3′非翻译区（3′UTR）结合，在转录后水平调控多种基因表达。本研究前期在对SCN1A 基因启动子区及编码区未发现突变的Dravet 综合征患者进SCN1A 基因3′UTR 突变筛查，发现一个新生突变NM_006920 c.*20A>G及一个遗传性突变c.*1794 C>T。物种间保守性分析发现，这两个位点在物种间相对保守，RNA 二级结构预测发现，这两个位点都会改变SCN1A 基因mRNA 3′UTR 的二级结构。提示这两个位点很可能是致病性突变。体外实验发现钠通道SCN1A 基因3 端非翻译区突变（c.*20A>G, c.*1794C>T）增强RNA 结合蛋白GAPDH 与SCN1A 基因3 端非翻译区结合，通过影响报告基因mRNA 稳定性，在转录后水平下调报告基因表达。提示GAPDH 转录后调控SCN1A 基因可能与DS 有关。进一步采用RIP 技术，探讨在体条件时，RNA 结合蛋白GAPDH 能否与钠通道SCN1A 基因mRNA 3′ UTR 结合，发现包含c.*20A>G突变位点的3′ UTR突变，序列是可以在体与RNA结合蛋白GAPDH结合。同时构建GAPDH 的慢病毒shRNA 干扰质粒，定位注射到大鼠海马组织， 干扰RNA 结合蛋GAPDH 表达后，Western Blotting 检测内源性的Nav1.1 蛋白表达情况，发现内源Nav1.1蛋白表达上升，可以认为Dravet 综合征钠通道SCN1A 基因3′ UTR 突变(c.*20A>G)是一个功能性突变。可能的致病机制是提高GAPDH 蛋白与钠通道SCN1A 基因3′ UTR 的结合力，降低Nav1.1 mRNA 稳定性，从而减少Nav1.1 的表达。这与单倍剂量不足现象相一致。给将来进一步研究SCN1A 基因3′ UTR 与SCN1A 相关疾病的关系提供了线索。

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